【關(guān)鍵詞】 大腸桿菌o157:h7；分子生物學(xué)；細(xì)菌分型技術(shù)
大腸桿菌是最常見的微生物之一，在自然界廣泛分布，在動(dòng)物體內(nèi)也存在。它具有易培養(yǎng)、生長(zhǎng)快、易變異等特點(diǎn)。腸出血性大腸桿菌(enterohemorrhagic e. coli，ehec)是大腸桿菌的一個(gè)變種，曾在多個(gè)國(guó)家暴發(fā)流行。目前美國(guó)、加拿大等國(guó)家也出現(xiàn)了新的耐藥性變種，導(dǎo)致了多人死亡。因此大腸桿菌致病變種引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的密切關(guān)注，并對(duì)大腸桿菌變種進(jìn)行了深入的研究。
筆者以ehec血清型o157：h7為例，對(duì)它的分子生物學(xué)檢測(cè)方法進(jìn)行綜述，為對(duì)該菌引起的疾病進(jìn)行預(yù)防、診斷和治療提供參考依據(jù)。
1 ehec基本概況
大腸桿菌 o157：h7 曾多次在世界各地，特別是發(fā)達(dá)國(guó)家引起廣泛的暴發(fā)流行。感染主要導(dǎo)致腹瀉、出血性結(jié)腸炎(hemorrhagic colitis，hc)，并經(jīng)常伴發(fā)溶血性尿毒綜合征(hemolytic uremic syndrome，hus)、血栓形成的血小板減少性紫癜( thrombotic thrombocytopenic purpura，ttp) 并發(fā)癥，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康。人類感染此菌的途徑主要是食用或接觸污染的牛肉、蔬菜、水果及水源等。
ehec菌株能產(chǎn)生毒素，編碼這些毒素的基因包括志賀菌素1基因(st x1)、志賀菌素2基因(st x2)、大腸桿菌粘附與消除基因(eae)和腸溶血素基因(ehx)等。大腸桿菌o157:h7是與人類疾病相關(guān)的最常見血清型細(xì)菌。1982年，美國(guó)學(xué)者首次從出血性腹瀉患者的糞便標(biāo)本中分離到該菌，并報(bào)道與食用漢堡牛肉餅有關(guān)。這是人類第一次認(rèn)識(shí)到大腸桿菌o157:h7可作為一種病原菌使人類致病，但當(dāng)時(shí)并沒(méi)有引起醫(yī)學(xué)界的足夠重視。此后，大腸桿菌o157:h7引起的感染在美國(guó)、加拿大、英國(guó)和日本等發(fā)達(dá)國(guó)家迅速增加，逐漸引起廣泛重視。我國(guó)于1987年由權(quán)太叔等首次從出血性結(jié)腸炎患者糞便中分離到o157:h7大腸桿菌。此后，福建、浙江、廣東、河北、寧夏等十幾個(gè)省陸續(xù)分離出該菌。為防止類似事件出現(xiàn)，1997年5月建立了全國(guó)o157:h7大腸桿菌檢測(cè)網(wǎng)絡(luò)。
大腸桿菌o157:h7對(duì)人的致病力較強(qiáng)，每克感染載體含菌10個(gè)以上即可能引起感染。因此，在流行病學(xué)調(diào)查中，特異、靈敏及快速檢測(cè)o157:h7的方法顯得尤為重要。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，使得快速、準(zhǔn)確檢測(cè)o157:h7成為可能，并為該領(lǐng)域的研究開拓了更廣闊的前景。
2 分子生物學(xué)檢測(cè)方法
2.1 聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)技術(shù)
該技術(shù)是最常用的檢測(cè)大腸桿菌o157:h7致病基因的方法。目前已從單一pcr發(fā)展到多重pcr乃至實(shí)時(shí)熒光定量pcr（rq- pcr ）。paton 等采用多重pcr 方法擴(kuò)增st x1 、st x2、eae、ehxa和saa基因，發(fā)現(xiàn)所檢測(cè)的etec(大腸桿菌o157:h7是其中一種)中，有幾種或全部為致病基因。fey 等對(duì)335份腹瀉患者的糞便樣品進(jìn)行選擇性細(xì)菌培養(yǎng)，再?gòu)闹羞x擇可疑菌落進(jìn)行檢測(cè)。用多重pcr的方法檢測(cè)到14株etec，與聯(lián)合應(yīng)用傳統(tǒng)的細(xì)菌分離培養(yǎng)和酶免疫法(enzyme immunoassay，EIA)相比，分離的菌株數(shù)相同。從而證明，pcr是一種與細(xì)菌常規(guī)分離培養(yǎng)和EIA聯(lián)合應(yīng)用、具有相同敏感性和特異性的方法。由于其速度快，可作為一種診斷由ehec感染引起腹瀉的替代方法。
近年來(lái)，隨著rq-pcr的發(fā)展，這種技術(shù)也被用于大腸桿菌o157:h7的檢測(cè)。rq-pcr是利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)pcr擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過(guò)ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析。常規(guī)pcr技術(shù)只能對(duì)pcr擴(kuò)增反應(yīng)的終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行定量和定性分析，無(wú)法對(duì)起始模板準(zhǔn)確定量，也無(wú)法對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)。rq-pcr通過(guò)對(duì)引物、探針或擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熒光標(biāo)記使對(duì)積累的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)成為可能。ct值即pcr擴(kuò)增過(guò)程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過(guò)的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)，模板DNA量越多，熒光達(dá)閾值的循環(huán)數(shù)越少，即ct值越小。朱海等使用rq-pcr檢測(cè)生果、蔬菜中大腸桿菌o157∶h7，說(shuō)明熒光定量pcr檢測(cè)方法比傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法靈敏度更高。bellin等在45min內(nèi)用這種方法檢測(cè)了32個(gè)ehec菌株中的st x1和st x2基因，證明實(shí)時(shí)定量pcr是一種快速檢測(cè)ehec的方法。同時(shí)，該試驗(yàn)對(duì)重復(fù)結(jié)果為陰性的試驗(yàn)也較為迅速。
因此，這種方法在處理大量懷疑含大腸桿菌o157:h7樣品時(shí)可使用，如在臨床微生物中糞便分析或食品安全性檢驗(yàn)中的應(yīng)用。
運(yùn)用pcr方法檢測(cè)與疾病相關(guān)的毒素基因還有助于對(duì)疾病發(fā)病機(jī)理的了解。有研究表明，從etec感染患者體內(nèi)分離的ehec中，大部分含有與毒力相關(guān)的90kb質(zhì)粒編碼的ehxa基因。從引起出血性腸炎和hus患者體內(nèi)分離的ehec中含有st x2和eae基因，而從無(wú)癥狀攜帶者分離的ehec缺少eae基因，說(shuō)明缺少eae基因也就使etec缺乏了腸上皮細(xì)胞的粘附機(jī)理。
2.2 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(rflp)
rflp是根據(jù)不同樣品(個(gè)體)基因組或某個(gè)基因的限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)之間發(fā)生了堿基的替換、重排、插入、缺失等，導(dǎo)致產(chǎn)生新的限制性酶切位點(diǎn)或丟失某些酶切位點(diǎn)。新切點(diǎn)的出現(xiàn)可使限制性片斷的長(zhǎng)度縮短，而舊切點(diǎn)的丟失可使限制性片斷的長(zhǎng)度增大。通過(guò)基因的pcr擴(kuò)增、限制性內(nèi)切酶酶切和瓊脂糖凝膠電泳分離，經(jīng)溴化乙錠染色后，在紫外光下直接觀察，可比較不同樣品(個(gè)體)dna水平的差異(即多態(tài)性)。
rflp是目前細(xì)菌亞分類最常用的方法之一，該法也被成功用于大腸桿菌o157:h7的多態(tài)性分析。zhang等用pcr-rflp對(duì)從人分離的大腸桿菌st x1基因的變化情況進(jìn)行了分析，從有腹瀉癥狀的患者分離的大腸桿菌中檢測(cè)到st xb1，無(wú)癥狀攜帶者分離的大腸桿菌中檢測(cè)到st xb1的等位基因(命名為st xb1c ) 。用限制性內(nèi)切酶fspⅰ酶切282bp 的st xb1及st xb1c，st xb1 酶切的結(jié)果得到189bp和93bp兩個(gè)片段；st xb1c沒(méi)有被切開，用限制性內(nèi)切酶hhaⅰ進(jìn)行酶切，st xb1得到135bp、92bp和55bp 3個(gè)片段；st xb1c得到218bp和64bp兩個(gè)片段。選擇包括edl933 的共6個(gè)菌株(均有st x1)作對(duì)照試驗(yàn)，酶切的結(jié)果與st xb1一致。從上述結(jié)果可見，只運(yùn)用pcr技術(shù)無(wú)法解釋相同病原菌編碼相同基因引起感染卻出現(xiàn)不同癥狀的情況，rflp 方法為大腸桿菌o157致病機(jī)理的研究提供了一條更加有效的途徑。
2.3 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性dna(rapd)
rapd建立在pcr基礎(chǔ)上，使用一系列具有10個(gè)堿基的單鏈隨機(jī)引物，對(duì)基因組的dna全部進(jìn)行pcr擴(kuò)增，以檢測(cè)其多態(tài)性。分析時(shí)所用引物數(shù)很大，雖對(duì)每一個(gè)引物而言，其檢測(cè)基因組的dna多態(tài)性區(qū)域有限，但利用一系列引物則可以使檢測(cè)區(qū)域幾乎覆蓋整個(gè)基因組。因此，rapd可以對(duì)整個(gè)基因組dna 進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)。目前該項(xiàng)技術(shù)也被用于大腸桿菌o157:h7的多態(tài)性檢測(cè)。
radu等對(duì)從15份牛肉和3份雞肉樣品中分離出的28株o157:h7分別進(jìn)行rapd和pfge分析，并繪制了進(jìn)化樹。rapd將其分為兩個(gè)組群，22個(gè)亞組群，pfge將其分為兩個(gè)組群，28個(gè)亞組群。johnson等對(duì)日本京都一家工廠暴發(fā)的大腸桿菌o157：h7感染調(diào)查中，也分別用rapd和pfge對(duì)從患者糞便中分離的o157：h7進(jìn)行了多態(tài)性分析，并與在東京暴發(fā)流行該病時(shí)分離的菌株進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)兩者的結(jié)果沒(méi)有差異。
在以pcr技術(shù)為基礎(chǔ)檢測(cè)dna多態(tài)型的眾多方法中，rapd是一種快速、簡(jiǎn)單的方法。它為大腸桿菌o157：h7提供了一種高效區(qū)分不同亞組群的方法。雖然相對(duì)于pfge其區(qū)分能力略遜一籌，但它快速簡(jiǎn)單，不像pfge需要較長(zhǎng)時(shí)間，可作為pfge方法的參照。另外，rapd對(duì)dna的要求不高，只需少量模板就可用于擴(kuò)增反應(yīng)，適用于從食物樣品和糞便中分離的多個(gè)菌株的分析。
2.4 隨機(jī)片段長(zhǎng)度多態(tài)性(aflp)
aflp技術(shù)由zobeau 等于1992 年創(chuàng)立。該方法結(jié)合了rflp 和rapd 技術(shù)的特點(diǎn)，利用兩種或兩種以上的酶切割dna ，形成不同酶切位點(diǎn)的限制性酶切片段，在所得的酶切片段上加上雙鏈人工接頭，作為pcr 擴(kuò)增的模板。對(duì)于pcr的引物，aflp作了修飾，將引物與酶切片段識(shí)別序列結(jié)合起來(lái)，其引物從5′→3′依次為核心序列、酶切識(shí)別序列、3′端選擇堿基序列。而核心序列與人工接頭互補(bǔ)，從而實(shí)現(xiàn)選擇性擴(kuò)增。dna 片段經(jīng)兩種或兩種以上的酶同時(shí)切割，如果遺傳特性發(fā)生改變，則酶切片段數(shù)目、長(zhǎng)短發(fā)生變化，從而實(shí)現(xiàn)多態(tài)性。
iyoda等分析了46株大腸桿菌o157:h7和其他血清型大腸桿菌o26：11、o114：19、o119：n，結(jié)果顯示，同一地區(qū)暴發(fā)分離的大腸桿菌o157：h7菌株的aflp條帶結(jié)果具有同一性，在亞分類時(shí)可將其歸入同一組群。該結(jié)果與脈沖凝膠電泳得出的結(jié)果一致。zhao等利用該方法對(duì)48株o157:h7進(jìn)行了分析，并在每對(duì)引物的一條引物帶上標(biāo)記熒光素，以便進(jìn)行儀器解讀，稱為熒光aflp(faflp)，共獲得37種不同基因組的dna指紋，pfge獲得21種，說(shuō)明faflp在一定條件下可以提供更詳細(xì)的pfge不能區(qū)分的dna樣品指紋圖。
smith等通過(guò)對(duì)71株o157進(jìn)行faflp分析表明，faflp較目前的分子生物學(xué)分類方法在理論上更為先進(jìn)，實(shí)際操作中更易于標(biāo)準(zhǔn)化。與pfge方法相比，它可得到的大量更為詳盡的數(shù)據(jù)，擴(kuò)增片段可精確到±1bp。在相同的消化連接反應(yīng)中，通過(guò)使用不同的選擇性引物，可提高或降低其鑒別能力。
aflp技術(shù)與rapd技術(shù)一樣，能產(chǎn)生豐富的多態(tài)性，但rapd技術(shù)是在高M(jìn)g2+濃度、低復(fù)性溫度、短引物序列(10bp)允許引物與模板錯(cuò)配等不嚴(yán)格條件下進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果易受外界因素的影響，重復(fù)性較差。aflp技術(shù)則不同，引物與模板嚴(yán)格配對(duì)的堿基數(shù)多達(dá)17個(gè)，且在56℃退火溫度下進(jìn)行，其結(jié)果的可靠性高于rapd。而rflp等技術(shù)需要預(yù)先制備相應(yīng)的dna探針并進(jìn)行雜交，才能得到較低多態(tài)性的結(jié)果。aflp技術(shù)克服了上述兩種方法的缺點(diǎn)，即能獲得較好的多態(tài)性，并且實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定、可靠、重復(fù)性好、分辨率高。但aflp技術(shù)也存在一些不足，如成本高、酶切條件及引物需要篩選、所需時(shí)間略長(zhǎng)。
2.5 脈沖場(chǎng)凝膠電泳(pfge)
pfge的基本原理是通過(guò)電場(chǎng)的不斷改變，使包埋在瓊脂糖凝膠中的dna分子的泳動(dòng)方向做相應(yīng)改變，小的dna分子比大的變化快，故小分子泳動(dòng)得快，從而在凝膠上按染色體大小而呈現(xiàn)出電泳帶型。dna帶的密度在一定程度上反映了細(xì)菌內(nèi)dna的含量以及dna分子的大小，最終達(dá)到分型的目的。
pfge常用于基因組dna的分析，是目前分子流行病學(xué)調(diào)查最經(jīng)典的方法，已成功用于眾多微生物的遺傳性分析，被世界上許多實(shí)驗(yàn)室作為菌株基因分型的參考方法，是迄今最常用的亞分類方法。目前對(duì)病原細(xì)菌常用的分子生物學(xué)分型方法有：rflp，特定片段pcr，rapd，基因外重復(fù)回文序列pcr(rep-pcr)，裂解酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性(cflp)，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(aflp),multiple-locus variable-number tandem repeats analysis,mlva)以及multiple-locus sequence typing,mlst)多位點(diǎn)序列分析等。pfge與以上方法相比，具有重復(fù)性好、分辨率高、結(jié)果穩(wěn)定、易于標(biāo)準(zhǔn)化的優(yōu)點(diǎn)，能在細(xì)菌基因組很龐大的情況下，盡可能反映較多的變異信息。但是也存在一定的缺點(diǎn)，比如耗時(shí)；電泳帶型易受人為等多種因素的影響；并不是對(duì)所有情況都適合；不能同時(shí)優(yōu)化膠的每個(gè)部分的條帶分布；不能確切地認(rèn)為相同大小的條帶就是相同的dna片段；不同條帶之間并不是無(wú)關(guān)的、相互獨(dú)立的，而是互相聯(lián)系的；一個(gè)酶切位點(diǎn)的變化可能引起不止一個(gè)條帶的變化；結(jié)果不易分析，沒(méi)有國(guó)際統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，不易于在實(shí)驗(yàn)室之間進(jìn)行比較，且儀器價(jià)格昂貴。
pfge適用于檢測(cè)較罕見的限制性內(nèi)切酶產(chǎn)生數(shù)量較少，而片段較大的dna片段，這些片段因分子量較大，常規(guī)電泳不能將其分開，但可用一個(gè)不斷變化的(脈沖)電場(chǎng)將其分開。美國(guó)國(guó)家公共衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)室已完成了pfge標(biāo)準(zhǔn)化流程的制定，并在多次不同的o157:h7暴發(fā)流行中應(yīng)用。xu等從113只金龜子中分離到4株大腸桿菌o157:h7，從383份腹瀉患者糞便中分離到10株大腸桿菌o157:h7。對(duì)分離到的14株o157:h7進(jìn)行基因組dna pegf分析，其中4株從金龜子分離的o157:h7與9株從腹瀉患者分離的o157:h7 pegf的結(jié)果一致，從而證明14株o157:h7具有相同的起源。金龜子可能通過(guò)接觸糞便而攜帶大腸桿菌o157:h7，并在糞便運(yùn)輸過(guò)程中傳播該菌。kruger等對(duì)分別來(lái)自牛(59株)、羊(4株)和腹瀉患者(33株)的大腸桿菌o157進(jìn)行rapd-pcr和pfge分型。rapd-pcr結(jié)果顯示，總共96株菌只是在條帶的亮度上有所差異，具有高度的單形性；pfge結(jié)果則可將96個(gè)菌株分為76個(gè)不同的基因組形式，證明了pfge在基因分型中的優(yōu)勢(shì)。radu等從食品中分離大腸桿菌o157進(jìn)行的基因分型試驗(yàn)也證明了pfge的優(yōu)越性。pfge已被證明，在大腸桿菌o157:h7的分子流行病學(xué)調(diào)查中是一種可靠的分型方法。
2.6 多位點(diǎn)可變數(shù)銜接重復(fù)序列分析(mlva)
mlva多用于哺乳動(dòng)物親緣關(guān)系的分析，近年來(lái)也被用來(lái)作細(xì)菌多態(tài)性檢測(cè)，已有多種細(xì)菌采用該方法進(jìn)行分型，如炭疽桿菌、耶爾森菌、結(jié)核分支桿菌。
在真核生物基因組中存在大量的數(shù)目可變的銜接重復(fù)序列(variable number tandem repeat，vntr)。vntr是由幾個(gè)核苷酸(最常見為2～4個(gè))作為核心序列串聯(lián)重復(fù)形成的dna序列，在原核生物基因組中也發(fā)現(xiàn)了這種序列，但它的一般長(zhǎng)度不到原核生物基因組的1/10。這種序列可存在于原核生物基因中，也可存在于基因之間。大腸桿菌o157：h7中發(fā)現(xiàn)，有7個(gè)vntr，重復(fù)數(shù)從6～30個(gè)堿基不等，其中6個(gè)存在于染色體dna上，另一個(gè)存在于編碼毒力基因的質(zhì)粒上。通過(guò)不同菌株基因組核心序列串聯(lián)重復(fù)數(shù)的差異，可檢測(cè)大腸桿菌o157：h7的多態(tài)性。
lindstedt等用mlva方法，將69株大腸桿菌o157分為45個(gè)不同型別，用pfge方法將它們分為44個(gè)，證明ml2va與pfge相比具有相同的靈敏度和更高的特異性，具有很多優(yōu)點(diǎn)。首先，它無(wú)需抽提基因組dna；其二，該法重復(fù)性好，即使不同實(shí)驗(yàn)者也可得到相同的條帶形式；第三，可制定統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，易于各實(shí)驗(yàn)室間進(jìn)行比較；第四，能在較短時(shí)間內(nèi)處理大量樣品。運(yùn)用分子生物學(xué)分型方法檢測(cè)大腸桿菌o157：h7的多態(tài)性，為調(diào)查其是否潛在暴發(fā)流行提供了有效手段。菌株的分型使得研究食品工業(yè)中o157：h7的污染檢測(cè)也更為方便，關(guān)鍵控制點(diǎn)易于找到，使得有適當(dāng)措施被貫徹來(lái)保證食品的安全。
綜上所述，大腸桿菌o157：h7有多種分子生物學(xué)檢測(cè)方法。不同的方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，我們應(yīng)該根據(jù)檢測(cè)目的和實(shí)驗(yàn)室擁有的條件選擇最適合的方法進(jìn)行檢測(cè)以及其他研究。
本文來(lái)源于：生物問(wèn)問(wèn)博客,原文地址：http://www.bioask.cn/html/386.html |
