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消化法原代培養(yǎng)兔胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞 用DMEM配0.2%的1型膠原酶（用20的血清的DMEM配可能更好，有類(lèi)似文獻(xiàn)），分裝于青霉素小并，每并2-3ml。1只免的胸主動(dòng)脈置于1 瓶消化液中消化，消化約10幾個(gè)小時(shí)（消化程度的把握要體會(huì)），離心后，接種（若見(jiàn)細(xì)胞量大，成功把握大），絕對(duì)靜置3天（沒(méi)必要看，看多了無(wú)益），8天可傳代。 犬胸主動(dòng)脈平滑肌貼塊法—— 方法成熟，比消化法好控制的多。 1、取材過(guò)程要快，取好放4度儲(chǔ)存的D-hanks液帶入超凈臺(tái)，不然先天不足； 2、塊大小密度影響不是很大（盡量?。P(guān)鍵是邊緣要盡量整齊，選用快刀快剪； 3、一定要貼牢，翻瓶時(shí)間個(gè)人不一，有3－5小時(shí)的，也有貼塊直接翻瓶的，關(guān)鍵還是貼牢，另外在貼牢的基礎(chǔ)上盡量早接觸培液，可以在剪塊的時(shí)候加少量培液略濕潤(rùn)，鑷子夾塊到培養(yǎng)瓶后，用吸管之類(lèi)的細(xì)長(zhǎng)工具將塊均勻鋪好，加剛好覆蓋組織塊的培養(yǎng)液量（25cm2培養(yǎng)瓶大概2ml），半小時(shí)到一小時(shí)內(nèi)就可翻瓶，動(dòng)作要輕，從培養(yǎng)瓶一角試著翻，如果塊飄起，則再過(guò)會(huì)翻； 4、貼塊無(wú)內(nèi)膜外膜面之分，亦無(wú)需刮除內(nèi)膜，若內(nèi)膜面向下，會(huì)有少量?jī)?nèi)皮細(xì)胞爬出組織塊，但只要平滑肌細(xì)胞一旦爬出來(lái)，內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)自然不占優(yōu)勢(shì)，會(huì)因?yàn)槠交〖?xì)胞大量爬出、增殖而漂起來(lái)，換液可洗掉，另外傳代可純化平滑肌細(xì)胞。 5、培液Gibco的 DMEM（高糖4500mg/L）加四季清新生牛血清20%。 建議用1次性培養(yǎng)瓶，成功機(jī)會(huì)大于玻璃瓶。成功后再小心過(guò)度成玻璃瓶。塊愈小愈好。用新刀，快，損傷小。全過(guò)程越短越好。組織塊的邊緣不齊整也不是什么很關(guān)鍵的問(wèn)題，最重要的是組織塊要盡量小，盡量能剪成小米粒大?。涣硗饩褪墙M織塊要貼牢，其關(guān)鍵就是培養(yǎng)液可以在6小時(shí)后翻瓶的時(shí)間再加，這樣就可以避免組織塊貼不牢而懸浮起來(lái)的尷尬了。 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)、鑒定及形態(tài)觀察 1.標(biāo)本采集 在無(wú)菌條件下于健康產(chǎn)婦分娩后立即取新生兒臍帶， 擠出臍帶血管中的血液，放入裝有含青鏈霉素的PBS液瓶中，2h之內(nèi)行臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)。 雙抗：青霉素100u/ml; 鏈霉素100μl/ml PBS：KCl 0.2 g/L, KH2PO4 0.24 g/L, NaCl 8.0g/L, Na2HPO4•7H2O 1.56g/L或Na2HPO4 1.44 g/L。 在800ml蒸餾水中加入上述質(zhì)量物質(zhì)，用鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.4，加水定容至1L，高壓蒸汽滅菌20分鐘，室溫保存。 2.原代血管內(nèi)皮細(xì)胞的獲取與培養(yǎng) 按Jaffe等人〔1〕的方法加以改進(jìn)。在無(wú)菌條件下取新生兒臍帶，剪去鉗痕和凝血塊阻塞部分，找到臍靜脈。一端插上帶有膠管的玻璃管結(jié)扎固定，經(jīng)膠管接注射器，用生理鹽水灌洗。待臍靜脈內(nèi)的殘血除凈后，用37℃ PBS，沖洗兩次，將另一端用鐵夾夾閉，向臍靜脈內(nèi)灌注0.25%胰蛋白酶8～10ml，夾閉膠管放入已滅菌的大平皿中。37℃孵育12min，在此期間經(jīng)常翻動(dòng)臍帶使酶溶液在血管內(nèi)流動(dòng)以促使內(nèi)皮細(xì)胞均勻與酶接觸。取出臍帶后輕輕擠壓管壁，將含有內(nèi)皮細(xì)胞的胰蛋白酶注入50ml錐形離心管中，加入小牛血清2ml終止酶反應(yīng)。再以30ml PBS沖洗管腔，流出液一并入離心管，1000r/min離心10min，棄上清，加入含有10%小牛血清的DMEM [或IMDM(Dibco)？]培養(yǎng)液，充分混合制成細(xì)胞懸液。取0.1ml細(xì)胞懸液在血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。最后調(diào)細(xì)胞數(shù)，以1×105/ml 接種至24孔培養(yǎng)板中，每孔1ml。置于5%CO2，37℃靜止培養(yǎng)24h更換培養(yǎng)液，以除去未貼壁的細(xì)胞。以后每隔2d換液1 次，以維持細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)和內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。 胰蛋白酶溶液（100ml）配制： 1）將D-Hanks（橙紅色）液高壓消毒滅菌，用NaHCO3液調(diào)節(jié)pH至7.2左右。 2）稱(chēng)取胰蛋白酶粉末置燒杯中，先用少許消毒的鹽溶液調(diào)成糊狀，然后再補(bǔ)足鹽溶液，攪拌混勻，置室溫4小時(shí)或冰箱內(nèi)過(guò)夜，并不時(shí)攪拌振蕩。 3）次日先用濾紙粗慮，再過(guò)濾除菌，分裝入瓶中，低溫冰箱或－20℃保存?zhèn)溆?，常用濃度?.25%或0.125%；胰蛋白酶溶液（深紅色）偏酸，使用前用NaHCO3調(diào)pH至7.2左右。 D－Hanks液配制：KCl 0.4g/L, KH2PO4 0.06 g/L , NaCl 8.0g/L, NaHCO3 0.35 g/L, Na2HPO4•7H2O 0.06g/L, 酚紅0.02 g/L 3．傳代內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng) 原代內(nèi)皮細(xì)胞融合后用培養(yǎng)液沖洗兩次，然后用0.25%胰酶加入到內(nèi)皮細(xì)胞中，每孔0.3ml。邊消化邊在倒置顯微鏡下觀察。細(xì)胞皺縮、彼此分離或呈大片狀分離即可終止消化。加入含有10%小牛血清的培養(yǎng)液，吸管吹打，制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后按105個(gè)細(xì)胞/ml，繼續(xù)培養(yǎng)。 4．血管內(nèi)皮細(xì)胞的鑒定 1）倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)特點(diǎn)。 2）VWF相關(guān)抗原免疫熒光檢查：在24孔塑料培養(yǎng)板孔內(nèi)放置無(wú)菌的蓋玻片0.5cm×0.6cm，每孔中種植1ml含有 105個(gè)細(xì)胞的原代或傳代內(nèi)皮細(xì)胞懸液。待內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)至近融合狀態(tài)時(shí)，取出蓋玻片，用PBS沖洗3次，投入冷丙酮中 (-18～-20℃)，細(xì)胞面向上，作用7min，用PBS沖洗3次，每次1min，而后進(jìn)行間接免疫熒光檢查，第一抗體為鼠抗人VWF單克隆抗體(蘇州醫(yī)學(xué)院血栓室提供)，1∶20倍稀釋?zhuān)尤?0μl于蓋玻片上，放入濕盒內(nèi)4℃過(guò)夜。同時(shí)不加一抗做陰性對(duì)照。用PBS沖洗3次后，加入異硫氫酸標(biāo)記的二抗50μl(異硫氰酸標(biāo)記羊抗鼠IgG，北京)，放入37℃2h后，用PBS洗滌3次。然后立即在熒光顯微鏡下觀察，攝片。 血管內(nèi)皮細(xì)胞鑒定結(jié)果： VWF相關(guān)抗原間接免疫熒光檢查，原代及傳代培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞漿中有黃綠色的熒光著色，胞核呈黑綠色，整個(gè)細(xì)胞輪廓清楚。作為對(duì)照的內(nèi)皮細(xì)胞片子中，偶見(jiàn)綠色斑點(diǎn)散發(fā)熒光，未見(jiàn)細(xì)胞輪廓。 5．內(nèi)皮細(xì)胞體外生長(zhǎng)情況 用胰蛋白酶消化的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，接種在24孔塑料培養(yǎng)板各孔內(nèi)4h后，大部分細(xì)胞貼壁。早期細(xì)胞呈小多角、球形、呈團(tuán)狀，少數(shù)細(xì)胞伸展，48～72h 生長(zhǎng)最快，逐漸生長(zhǎng)成梭形，有些細(xì)胞排列呈魚(yú)貫狀相連，間有旋禍狀排列。核清晰，呈圓形或橢圓形，核分裂相多見(jiàn)，1～2核仁，胞漿豐富，內(nèi)含小顆粒。于 3～4d后融合，7～10d胞體呈多角形，相互嵌合，為單層呈鋪路石狀排列。 人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)與增殖試驗(yàn)（劉 金） 血管內(nèi)皮細(xì)胞不僅參與調(diào)節(jié)血管通透性和凝血過(guò)程，在免疫調(diào)節(jié)，移植排斥，腫瘤轉(zhuǎn)移，炎癥等許多過(guò)程中也具有重要作用。內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)是體外研究?jī)?nèi)皮細(xì)胞功能的重要手段。70年代Eric等建立了內(nèi)皮細(xì)胞分離及體外培養(yǎng)的方法。人臍帶靜脈是人血管內(nèi)皮細(xì)胞最易獲取的來(lái)源，在人內(nèi)皮細(xì)胞的研究中被普遍采用。 ㈠ 原理 在體外，內(nèi)皮細(xì)胞在內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子存在的條件下可迅速增殖，并可傳代，可作為內(nèi)皮細(xì)胞增殖，細(xì)胞因子分泌、表型等研究的模型。 ㈡ 方法 1. 臍帶內(nèi)皮細(xì)胞的分離 試劑與器材 （1）膠原酶(Sigma)：I型 ((C-0130),用無(wú)血清RPMI 1640配成0.1%(W/V),分裝、-20℃保存。 0.1％明膠：稱(chēng)取明膠，用三蒸水配成0.2％(W/V)溶液，37℃水浴溶解，過(guò)濾，放4℃?zhèn)溆谩?即用過(guò)濾法消毒) （2）Cord Buffor 肝星狀細(xì)胞培養(yǎng) 材料 相差顯微鏡，熒光顯微鏡，手術(shù)器械，雄性SD大鼠，體重250-450 g，戊巴比妥鈉，200目尼龍網(wǎng)，小牛血清（或胎牛血清，則更好），DMEM，胰酶消化液（以HBSS配），Nycodenz（以GBSS配），D- Hanks'（KCl 0.4 g/L，KH2PO4 0.06 g/L，NaCl 8.0 g/L，NaHCO3 0.35 g/L，Na2HPO4.7H2O 0.06 g/L或Na2HPO4 0.053 g/L，可加酚紅 0.02 g/L），HBSS，臺(tái)盼蘭等。 方法 大鼠腹腔麻醉--<剖腹 --<門(mén)靜脈插管-- 傳代方法：棄培液--<以D- Hanks'液洗兩次--<0.125％胰酶（原代最好加0.05% EDTA）消化--<鏡下觀察細(xì)胞突起回縮（2-5分鐘左右）--<以完全培液（DMEM+10% NBS）終止反應(yīng)（若不用EDTA，可以不需離心）--<吹打，1:2-1:3接種，然后繼續(xù)培養(yǎng)（5% CO2，37度）。 結(jié)果 次日，光鏡下可見(jiàn)細(xì)胞呈星芒狀，胞質(zhì)內(nèi)有脂滴，熒光鏡下328 nm處見(jiàn)自發(fā)熒光。 討論 進(jìn)一步鑒別需要做免疫組化：Desmin和alpha-SMA；后者在細(xì)胞激活后才表達(dá)。也采用過(guò)無(wú)須原位消化的方案，完全可行，只不過(guò)消化時(shí)間更難控制！ 參考文獻(xiàn) 袁桃霞，張錦生，張?jiān)露?，? 大鼠肝Ito細(xì)胞的體外培養(yǎng)及肝素對(duì)其抑制作用的觀察. 上海醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào) 1996;23(2):90-93。 乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)方法詳述 一．材料 所需液體：Hanks液、低糖DMEM液、高糖DMEM液、胰酶消化液、雙抗液、碳酸氫鈉液、鹽酸液。 試劑 Trypsin, SDS, DMEM 均購(gòu)于 Sigma Chemical Co.小牛血清購(gòu)于杭州四季青生物制品有限公司，其余均為國(guó)產(chǎn)分析純。 取鼠：標(biāo)準(zhǔn)SD大鼠，鼠盆用棉鋪好，取鼠。 物品：白大衣、飯盒 小剪子、小鑷子（4套）（一套剪皮膚、一套開(kāi)胸取心，一套剔除心緣纖維組織，一套剪碎心臟） 瓶皿（2套）[兩個(gè)小圓培養(yǎng)皿，培養(yǎng)皿內(nèi)加DMEM液，先后裝取出的心和剔出纖維組織后的心] [一個(gè)小燒杯裝碘酒和酒精棉球] 250ml燒杯3個(gè)[一個(gè)用于水浴，事先加好水，最好是一或二蒸] [一個(gè)裝0.1％新潔爾滅150ml左右，消毒小鼠] 500ml燒杯1個(gè)，用作廢液缸。 50ml燒杯3個(gè)（剪碎心肌組織，最后配液） 三角燒杯（50ml）+小轉(zhuǎn)子（小轉(zhuǎn)子，酒精擦，雙蒸水沖后，再把酒精徹底沖掉后用三角燒杯高壓） 離心管及帽（12-14個(gè)），兩個(gè)試管 吸管 （5~8個(gè)）大鑷子 （兩把，持物，例夾棉球等） 臺(tái)面：磁力攪拌器、紗布（事先用于托盤(pán)裝0.1％新潔爾滅浸泡）、試管架、泡沫塑料板、五個(gè)針頭（不用消毒）75％酒精棉球及碘酒（消毒棉球，泡酒精、碘酒）大鑷子兩把（一把夾棉球，一把取鼠）、3個(gè)250ml燒瓶（一個(gè)裝一蒸水，一個(gè)裝新潔爾滅，另一為空的備用）1個(gè) 500ml燒瓶（廢液缸）、溫度計(jì)、PH試紙（事先調(diào)PH值）、酒精燈、打火機(jī)/火柴、載玻片（5-10個(gè)）[用于培養(yǎng)前看接種密度及消化后看細(xì)胞密度]、注射器5ml 6個(gè)（胰酶、DMEM、小牛血清）1ml 2個(gè)（雙抗液）20ml備用 2個(gè)、微量加樣器1000ml及500ml 以上物品均用紫外線照30分鐘。 另外準(zhǔn)備手套、帽子、口罩、24孔培養(yǎng)板、離心機(jī)、未凍藥品及DMEM、HCL、NaHCO3、小牛血清。 事先把顯微鏡、離心機(jī)、磁力攪拌器電源插好。檢查酒精燈是否有酒精，碘酒和酒精棉球是否夠用。先把物品遞入，后穿大衣、帽子和口罩。然后把酒精燈打開(kāi)，把瓶皿擺好，再用一個(gè)瓶皿裝酒精棉球。 二．培養(yǎng)方法： 事先檢查顯微鏡、磁力攪拌器及離心機(jī)是否好用，提前三小時(shí)把小牛血清、胰酶、抗生素拿出來(lái)化開(kāi)。其余未凍藥品也提前20分鐘拿出來(lái)緩和一下。新潔爾滅（0.1％）泡紗布（用10ml5％的新潔爾滅加水至500ml即得），消毒地面（1：500的84液），用酒精棉球擦拭臺(tái)面后把物品擺放好，開(kāi)紫外線燈照30分鐘后開(kāi)鼓風(fēng)機(jī)吹至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。 具體方法為： 1. 把兩個(gè)5ml注射器分別插入DMEM和胰酶中，分別向兩個(gè)圓皿中加入5ml的DMEM培養(yǎng)液。用一把大鑷子從鼠盆里取出一只生后2~3天的SD大鼠，放入 0.1％新潔爾滅浸泡一下后拿出放在泡沫板上，用針頭把鼠固定（位置擺正），用另一把大鑷子取碘酒棉球擦皮膚，再用酒精棉球脫碘，取一把小剪子及小鑷子開(kāi)皮，充分撕拉開(kāi)，再用酒精棉球消毒，后換另一把小剪子和鑷子在劍突處正中線稍偏左開(kāi)胸取心。
2. 取出的心放在剛才準(zhǔn)備的一個(gè)裝有DMEM的圓皿中再取下一只。重復(fù)以上過(guò)程。（鼠全部殺死后，把取鼠鑷及泡沫板、新潔爾滅缸等拿出臺(tái)面。消毒、清潔，鋪紗布、換手套。 3．用第三副剪子和鑷子把圓皿中的心臟周邊的血凝及纖維組織剔除掉，放在另一個(gè)預(yù)先裝好DMEM的圓皿中。抽取5ml的胰酶，然后將其中少許放入50ml的小燒杯中，大部分倒入三角燒瓶中。用第四副剪子將燒杯中的心臟剪成1mm3的碎塊，倒入三角燒瓶中（可用剪刀刮入），再用剩余胰酶刷凈燒杯。 4．把溫度計(jì)和三角燒杯放入250ml燒瓶中，（事先調(diào)好水量，多會(huì)沒(méi)過(guò)三角燒杯，少溫度會(huì)不均勻）。打開(kāi)磁力攪拌器電源，調(diào)溫度（使-緩慢加到34~35℃）和轉(zhuǎn)速（轉(zhuǎn)速不可過(guò)快，否則會(huì)打碎細(xì)胞，基本上標(biāo)志為平行）。一定要注意監(jiān)控。 5．溫度達(dá)到34℃時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，第一次為10分鐘，以后可為8分鐘，事情況而定。在此期間，在試管架上擺上5、6個(gè)離心管，標(biāo)上1、1，2、2。其中在1號(hào)兩管事先加入DMEM液各2毫升 6．10分鐘后，把三角燒瓶取下，磁力攪拌器關(guān)上，用一個(gè)吸管輕輕吹打（使消化下來(lái)的細(xì)胞徹底從組織團(tuán)快上掉下來(lái)），這個(gè)吸管（1）用后固定放在一個(gè)離心管中，以后每次消化后取下都用其吹打幾下，第一次上清棄去，然后向兩個(gè)1號(hào)管分別倒入2ml上清（盡量不要把組織倒出，也不要剩液太多，以免消化下的細(xì)胞重復(fù)消化造成損傷），用另一個(gè)吸管（2）混勻配平兩個(gè)管（即兩個(gè)管水平高度相同），輕輕吹打，以免損壞細(xì)胞。 7．接著把這兩個(gè)離心管放入離心機(jī)中，調(diào)10分鐘，800或1000轉(zhuǎn)，打開(kāi)關(guān)。 8．同時(shí)向三角燒瓶中加入5ml胰酶，繼續(xù)消化8分鐘，注意控制溫度。此時(shí)向兩個(gè)2號(hào)管中分別加入2mlDMEM液。 9．取下三角燒瓶，仍用1號(hào)吸管吹打，后靜置片刻向兩個(gè)2號(hào)管分別倒入2毫升的上清，取出兩個(gè)離心后的1號(hào)管，把上清液沿細(xì)胞貼壁一方慢慢倒掉，后向其中一管加入4ml的DMEM液，用2號(hào)吸管取少量液體加入另一個(gè)離心管中，把管底的沉淀細(xì)胞洗下來(lái)，把液體全部移入其中一管，三個(gè)管（1個(gè)1號(hào)管，兩個(gè)2號(hào)管）配平，放入離心管中，離心十分鐘。同時(shí)仍加5ml的胰酶，放入三角燒瓶中，繼續(xù)消化（注意控制溫度，達(dá)34℃時(shí)計(jì)時(shí)）。 10．消化到4次左右，吹打均勻后，吸一滴滴在載玻片上，拿到鏡下觀察消化情況，決定消化次數(shù)。 11．離心2次的吸管，放在試管架上，待離心過(guò)程全部完事后，把各管上清液倒掉，在各管加上3ml（不用精確，大致這樣）DMEM液，記住共加入多少DMEM液的量，換吸管（3號(hào)）把各管底細(xì)胞塊吸下吹打均勻后，移入50ml燒杯中，然后用注射器抽取余量的DMEM加入燒杯中，加入小牛血清及抗生素，換吸管（4號(hào)）吹打均勻。 12．取出24孔培養(yǎng)板，一個(gè)人吹打，另一個(gè)人用加樣器加藥。封蓋時(shí)過(guò)火，蓋上蓋，放在CO2孵箱。24小時(shí)后觀察是否貼壁。 （24孔板，每孔最多加2ml，一般加液時(shí)每孔加1~1.5ml） 三．討論 乳鼠心肌細(xì)胞屬于原代生長(zhǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)過(guò)程較為繁瑣。文獻(xiàn)上有多種濃度胰酶消化方法，我們?cè)谠囼?yàn)中摸索到0.06％濃度的胰酶對(duì)細(xì)胞損害較小，比起一些文獻(xiàn)記載的0.15％濃度有一定的優(yōu)越性，但這個(gè)濃度消化所需時(shí)間較長(zhǎng)，所以我們又采取多次反復(fù)低濃度消化的方法，每次消化一些后，用吸管抽取出上清液，離心所得即為心肌細(xì)胞。利用心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞貼壁時(shí)間的不同, 采用差速貼壁1 h, 除去成纖維細(xì)胞，達(dá)到純化的目的。成纖維細(xì)胞胞體呈梭型或不規(guī)則三角形，中央有卵圓形核，胞質(zhì)突起，生長(zhǎng)時(shí)呈放射狀。很好和心肌細(xì)胞鑒別[1]。 心肌細(xì)胞剛接種時(shí)形狀為圓形或橢圓形，大約在一天左右基本貼壁，此時(shí)細(xì)胞伸出偽足，偽足在鏡下為纖維狀條索，細(xì)胞胞體則呈現(xiàn)不規(guī)則形狀，如多角形，部分細(xì)胞有聚集傾向，細(xì)胞搏動(dòng)效果較好，DMEM培養(yǎng)基在初始培養(yǎng)時(shí)為深紅色，兩天后變?yōu)榈S色，應(yīng)該是營(yíng)養(yǎng)成分下降的表現(xiàn)，也說(shuō)明細(xì)胞生長(zhǎng)狀況良好。我們也參考了一些國(guó)外文獻(xiàn)的培養(yǎng)方法加以補(bǔ)充[2]。 四．參考文獻(xiàn) 1.Wang HX, Zhang WM, Sheng JZ, Wong TM. High carbachol increases the electrically induced [Ca2+]I transient in the single isolated ventricular myocyte of rats [J]. Eur J Pharmacol, 1997；319：91-9 2.Animal cell culture methods edited by Jennie P.Mather and David Barnes.--California:Academic Press,c1998.--xiv,368p.24cmSBN0124800408:CNY619.26 原代胚胎成纖維細(xì)胞培養(yǎng) 一、實(shí)驗(yàn)器材：手術(shù)小直剪刀三把、眼科直鑷子三把、眼科彎鑷子兩把、玻璃平 皿三套、200目尼龍濾網(wǎng)、50ML、15ML離心管和手術(shù)刀片。以上物品均需要高壓滅菌消毒處理。 二、實(shí)驗(yàn)試劑：無(wú)Ca+2和Mg+2的 PBS、0.05%胰酶0.53mmol/L EDTA溶液、小鼠胚成纖維細(xì)胞（MEF）生長(zhǎng)培養(yǎng)基:高糖DMEM加10%FCS。 三、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：孕期14至16天的孕鼠 四、實(shí)驗(yàn)步驟： 1. 處死孕鼠，置于75%酒精里全身浸泡，然后在超凈臺(tái)中用一把剪刀和一把鑷子把孕鼠外皮剪開(kāi)，用另外一把剪刀和一把鑷子把內(nèi)皮剪開(kāi)，露出子宮，最后用第三把剪刀和鑷子將子宮小心取出放在盛有PBS的玻璃平皿中，沖洗去血。 2.用兩把彎鑷子將胚胎外的胞膜小心去除，然后夾掉頭和內(nèi)臟，將其余胚胎轉(zhuǎn)移到一個(gè)裝有30MLPBS的50ML離心管中，輕輕顛倒兩次，倒掉PBS，再重復(fù)此步驟一次，留少許PBS將胚胎轉(zhuǎn)移到另一裝有PBS的平皿中，用手術(shù)刀片將其細(xì)細(xì)切碎。 3.用200ul的移液槍反復(fù)快速吹打平皿中的液體，放在15ML離心管中，4℃1500rpm離心5分鐘，倒掉上清，加10ML胰酶，重懸沉淀，放37℃水浴中消化30分鐘，且每隔五分鐘輕輕晃動(dòng)，使之充分消化。 4.將上層細(xì)胞懸液倒入一裝有 10MLMEF生長(zhǎng)培養(yǎng)基的50ML離心管中，用200目尼龍濾網(wǎng)過(guò)濾后，1500rpm離心5分鐘收集細(xì)胞。30ML MEF生長(zhǎng)培養(yǎng)基洗滌兩次（此步驟中作者試過(guò)用無(wú)血清的培養(yǎng)基洗滌，結(jié)果無(wú)差別）。 5.細(xì)胞沉淀用15ML生長(zhǎng)培養(yǎng)基懸起，細(xì)胞計(jì)數(shù)（八只14天胎鼠可獲得2-3×107細(xì)胞）。 6.3×106細(xì)胞懸浮于15ML MEF生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，接種到200ML的培養(yǎng)瓶中。 7.24小時(shí)后更換新鮮的MEF生長(zhǎng)培養(yǎng)基。 8.細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)后，先用PBS沖洗，倒掉，加胰酶消化（此步時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，作者一般不超過(guò)五分鐘），按1：5傳代。 9.細(xì)胞再次長(zhǎng)到覆蓋率80-90%左右，將其消化后，常規(guī)凍存。（凍存液要現(xiàn)配） 五、討論 1.原代培養(yǎng)，一定要避免污染。 2. MEF生存能力有限，如果不凍存，體外存活十代左右。 3. 凍存后復(fù)蘇的細(xì)胞只能傳代一次，因?yàn)檫@些細(xì)胞繁殖能力有限。 4. 消化細(xì)胞時(shí)間不要過(guò)長(zhǎng)。 大鼠皮層神經(jīng)元原代培養(yǎng) 液體配制： 硼酸硼砂緩沖液：0.05M四硼化鈉45ml，0.2M硼酸55ml，pH8.4； 胰酶－EDTA消化液：胰酶－0.125g；EDTA－0.2g；D-Hanks平衡鹽液定容至100ml 所用的培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶或玻片預(yù)先經(jīng)100μg/L多聚賴(lài)氨酸硼酸鹽緩沖液于37℃包被4h，三蒸水洗三遍晾干備用。 操作步驟如下： 1. 孕16d SD大鼠經(jīng)戊巴比妥鈉麻醉后，碘酒、75％乙醇消毒腹部皮膚，依次剪開(kāi)皮膚、肌肉、皮下筋膜，無(wú)菌操作下取出胚胎放入預(yù)冷的D-Hanks平衡鹽液中。 2.在解剖顯微鏡下分離并取出胚胎大腦皮層，除去腦膜，剪碎組織成約1mm3大小，加入胰酶-EDTA消化液并放入37℃孵箱內(nèi)消化20min，中間搖晃一次。 3. 隨后用滴管吸出組織轉(zhuǎn)移到裝有預(yù)冷的培養(yǎng)液（DMEM＋10％FBS）的離心管內(nèi)終止消化液作用5min。 4. 用滴管吸出組織轉(zhuǎn)移到裝有預(yù)冷的DMEM＋10％FBS的離心管內(nèi)，用火焰拋光的巴斯德滴管吹打數(shù)次，靜置后取上清吸到另一支離心管內(nèi)。重復(fù)上述步驟2～3次。 5. 將所收集的上清經(jīng)200目篩網(wǎng)過(guò)濾。 6.過(guò)濾后的細(xì)胞懸液于800r/min離心5min，棄上清，管內(nèi)加入新鮮培養(yǎng)液（DMEM＋20％FBS）并吹打成單細(xì)胞懸液。 7. 細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度按1.5×105/cm2種入6孔板內(nèi)，放入CO2孵箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)48h后換液并加入Ara- C使其終濃度為1×10-5mM/L。Ara-C作用24h后全量換液。以后每隔3天半量換液一次。 『注意以下幾點(diǎn)』 1.上面的步驟是傳統(tǒng)方法。有許多地方可以進(jìn)行改動(dòng)：如消化時(shí)可以直接用0.125－0.25的胰酶消化15－20min左右，也可用DNA酶進(jìn)行消化，有人還直接進(jìn)行吹打，都可行。 2.上面雖然時(shí)大鼠皮層神經(jīng)元，但是同樣適用于小鼠，但是應(yīng)該選擇 孕13d 左右的小鼠。 3.神經(jīng)元是一種比較難培養(yǎng)的細(xì)胞，因此在接種時(shí)細(xì)胞的密度一定要夠！！ 4.在玻片上培養(yǎng)神經(jīng)元時(shí)，一定要注意玻片的來(lái)源和處理方法，這個(gè)非常重要，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的影響是很大的。如果您現(xiàn)在在玻片上培養(yǎng)的神經(jīng)元生長(zhǎng)情況還不錯(cuò)的話(huà)，那么您在以后的培養(yǎng)中最好還是用同一來(lái)源（廠家）的玻片。 5.如果有B27和neurobasal培養(yǎng)基，那么就方便了（不用加AraC）－－ 1）把細(xì)胞懸液用（DMEM＋20％FBS）懸浮，種到培養(yǎng)皿上6－12h后，全量換成2％B27的neurobasal培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，3d半量換液。 2）把細(xì)胞懸液用直接用2％B27的neurobasal培養(yǎng)基懸浮接種。 3）可以用新生1d內(nèi)的胎鼠皮層直接培養(yǎng)。 膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)（astrocyte, oligodendrocyte） 取材及膠質(zhì)細(xì)胞的混合培養(yǎng) 1.P2 SD大鼠經(jīng)低溫麻醉后以碘酒和75％乙醇消毒，無(wú)菌操作下，斷頭放入預(yù)冷的D-Hanks液中，在解剖顯微鏡下取大腦皮層并除去腦膜。 2. 剪碎組織成1mm3大小，加入胰酶 -EDTA消化液并放入37℃孵箱內(nèi)消化20min，中間搖晃一次。 3. 隨后用滴管吸出組織轉(zhuǎn)移到裝有預(yù)冷的MEM＋10％FBS（Glial Medium，GM）的離心管內(nèi)終止消化液作用5min。 4. 吸出組織轉(zhuǎn)移到另一支裝有冷的GM的離心管內(nèi)，用火焰拋光的巴斯德滴管吹打數(shù)次，靜置后取上清并吸到另一支離心管內(nèi)。重復(fù)上述步驟2～3次。 5.所得上清于800r/min離心 5min，棄上清，管內(nèi)加入新鮮GM并吹打成單細(xì)胞懸液。細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度按1.5×105/cm2種入25cm2培養(yǎng)瓶，放入孵箱培養(yǎng)。以后每隔2～3d進(jìn)行全量換液。 搖床振搖分離星形膠質(zhì)細(xì)胞和寡突膠質(zhì)細(xì)胞 培養(yǎng)至7～10天，換液后放入孵箱繼續(xù)培養(yǎng)24h，取出擰緊培養(yǎng)瓶蓋，于37℃恒溫?fù)u床上280r/min搖動(dòng)18h。此時(shí)寡突膠質(zhì)細(xì)胞90％以上在培養(yǎng)懸液內(nèi)而與瓶底貼壁的星形膠質(zhì)細(xì)胞分離。 分離培養(yǎng)懸液內(nèi)的寡突膠質(zhì)細(xì)胞 吸出懸液至離心管內(nèi)950r/min離心 10min，棄上清后管內(nèi)加入新鮮GM，吹打成單細(xì)胞懸液，按1.5×105/cm2種入預(yù)先用 100μg/L多聚賴(lài)氨酸包被好的35mm培養(yǎng)皿培養(yǎng)。24h后換成DF12＋N2的無(wú)血清培養(yǎng)液，此后每三天半量換液1次。 瓶底星形膠質(zhì)細(xì)胞的繼續(xù)培養(yǎng) 25cm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的星形膠質(zhì)細(xì)胞用D-Hanks液洗2次后常規(guī)傳代，以1.5×105/cm2種入預(yù)先用100μg/L 多聚賴(lài)氨酸包被好的35mm培養(yǎng)皿培養(yǎng)。培養(yǎng)液為GM，每三天半量換液1次。 動(dòng)脈粥樣硬化患者VSMC的提取 實(shí)驗(yàn)材料：眼科剪刀1把 眼科鑷子2把 1×PBS約200ml M199培養(yǎng)液 離心機(jī) 5ml小皿 10ml大皿 實(shí)驗(yàn)步驟： 1.在超凈臺(tái)內(nèi)用10ml的離心管分裝5ml的1×PBS（已高壓滅菌）。 2.手術(shù)臺(tái)上取患者發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化改變的病變動(dòng)脈，分放入準(zhǔn)備好的PBS中，拿回實(shí)驗(yàn)室在超凈臺(tái)中，無(wú)菌條件下剝?nèi)ネ饽?，用手術(shù)刀片刮去內(nèi)膜，留下中膜并將其剪成1×1mm大小組織塊。 3.消化法：PBS清洗組織塊后并將其轉(zhuǎn)移入10ml的離心管，加入0.125％胰酶消化37℃30分鐘，室溫吹打100分鐘或者振蕩器振蕩100分鐘，待組織塊變小且消化液變粘時(shí)，收集消化液配平以1500轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘后，收集細(xì)胞種植于預(yù)先加入M199培養(yǎng)液的 5ml小皿中放入37度5％CO2的培養(yǎng)箱中。 4.貼塊法：PBS清洗組織塊后移入已準(zhǔn)備好的10ml大皿中，塊間距為0.5cm，放入37度5％CO2的培養(yǎng)箱中，3小時(shí)后，待組織塊貼壁后，再加入2ml培養(yǎng)液后放回37度5％CO2的培養(yǎng)箱中。注意：最后加入2ml培養(yǎng)液時(shí)應(yīng)使其順無(wú)組織塊的皿邊緣緩慢流下，勿使組織塊吹下。 5.隨后每3天予以半量換液。 6.一周后可見(jiàn)組織塊周?chē)屑?xì)胞爬出，大約3周后80%融合。因本人系非細(xì)胞生物學(xué)專(zhuān)業(yè)人員，本細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間又很短，多次進(jìn)行細(xì)胞傳代未成功，還望有經(jīng)驗(yàn)的專(zhuān)家指點(diǎn)。 膀胱平滑肌細(xì)胞細(xì)胞原代培養(yǎng) 1.麻醉后消毒，下腹正中切口于膀胱頸（結(jié)扎處遠(yuǎn)端約1~2cm） 2.嚴(yán)格無(wú)菌操作取出標(biāo)本、手術(shù)臺(tái)位于超凈臺(tái)旁 3.在超凈臺(tái)，40u/ml慶大霉素溶液中浸泡5分鐘 4.生理鹽水漂洗1次 5.D－h(huán)anks液漂洗1次 6.放入D－h(huán)anks液中，除去粘膜、粘膜下及漿膜 如果是Shame組兔，以10ml注射器抽取約8ml D－h(huán)anks液，于粘膜層下注射起泡后，剪去粘膜層，直接剪取平滑肌組織，棄漿膜層及其上未剪下之肌組織。 new: 如果是不全BOO兔，則可將膀胱剪成寬約0.5cm之條狀，撕去粘膜層后，助手以一眼科鑷將該組織一端固定，眼科鑷與該組織垂直，并夾持整個(gè)橫截面，術(shù)者同法夾持于附近，助手持第3把眼科鑷提起肌組織，術(shù)者以手術(shù)刀銳性分離肌層；如此，向另一端推進(jìn)，銳性分離肌條。 7.在超凈臺(tái)，取相當(dāng)于0.5為X0.5 CM2肌塊，室溫下將其剪碎成1~2mm碎組織塊 8.轉(zhuǎn)移入離心管 9.加入D－h(huán)anks液(操作成功) OR Dulbecco 10.離心1000轉(zhuǎn)/min，10分鐘 離心半徑13cm，棄上清 11.加入I型膠原酶（2mg/ml） 5mg,(II型膠原酶2mg/ml 5mg也可，但效果不如I型膠原酶) 12.不要加入DMEM為主要成分的培養(yǎng)液(否則胰蛋白酶失活) 13.轉(zhuǎn)移入培養(yǎng)瓶中 14.4度下過(guò)夜孵育。 15.加0.25%胰蛋白酶 16.36.5度振蕩消化 15~30min,棄上清。(可省) 17.200目(74um)不銹鋼網(wǎng)過(guò)濾。(可省) 18.轉(zhuǎn)移入離心管,吹打后待可見(jiàn)物沉淀，吸盡沉淀（避免組織塊培養(yǎng)法） 19.離心1000轉(zhuǎn)/min，10分鐘 離心半徑13cm，棄上清 20.加培養(yǎng)液至10ml(ok) 21.轉(zhuǎn)移入培養(yǎng)瓶中 22.CO2恒溫箱中培養(yǎng) 23.12h后收集未貼壁細(xì)胞并計(jì)數(shù) 家兔椎間盤(pán)(intervertebral disc )細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法 Material and method： Material : 1. 培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶、燒瓶、試管等。 2. 分離組織需要的眼科剪子、眼科鑷子。 3. 5%CO2孵箱、PH計(jì)、95%氧氣源。 4. 36電動(dòng)恒溫水浴。 5. 培養(yǎng)液、各種緩沖液及添加劑DMEM高糖培養(yǎng)基、Hank’s緩沖液 、20%胎牛血清，轉(zhuǎn)換生長(zhǎng)因子（TGF-β1）(5ng/mL)、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒（10ug/mL胰島素，5ug/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白，和0.5ng /mL亞硒酸鹽）青霉素100U/Ml，鏈霉素100U/ml 。 6. 消化液 膠原酶(collagenase) 200U/ml 0.4%臺(tái)盼蘭、0.25胰蛋白酶 Method 1 組織塊法 1. 取材：空氣栓塞法處死家兔后，在無(wú)菌狀態(tài)下獲取家兔椎間盤(pán)組織。置于準(zhǔn)備好的DMEM培養(yǎng)基（含雙抗）。迅速帶回到無(wú)菌超凈臺(tái)上。（注意事項(xiàng)：椎間盤(pán)位于相鄰兩個(gè)椎體之間，取材過(guò)程較為繁瑣，要求動(dòng)作迅速，爭(zhēng)取在家兔死后半小時(shí)內(nèi)完成，否則，該組織對(duì)缺氧耐受性差導(dǎo)致培養(yǎng)失?。?。 2. 剪切：在超凈臺(tái)上，進(jìn)一步將周?chē)M織分離，用Hank’s液沖洗數(shù)遍，直到?jīng)_洗液透明為止。眼科剪刀將組織修剪為1~2cm3大小的小組織塊，Hank’s沖洗干凈。 加入少量含血清的培養(yǎng)液。(組織塊不宜過(guò)小，否則不容易爬出足夠數(shù)量的細(xì)胞) 3. 接種：用吸管吸取小組織塊入培養(yǎng)瓶底部，擺放均勻，一個(gè)25cm2的培養(yǎng)瓶可放置10-15個(gè)小組織塊，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，加入少量培養(yǎng)液。4~6小時(shí)后，待組織塊充分貼壁后，再翻轉(zhuǎn)回來(lái)（動(dòng)作一定要輕巧，以免剛剛貼壁的組織塊脫離瓶底） 4. 置于5%CO2孵箱中培養(yǎng)，每隔3天換液。待細(xì)胞95%融合時(shí)，0.25%胰蛋白酶?jìng)鞔制俊?/p> Method 2 消化法 前面步驟同組織塊法1，2。 3.組織塊再進(jìn)一步剪切，此時(shí)培養(yǎng)液中最好不加血清。完畢后，加入消化液，移入到10ml 離心管，培養(yǎng)箱內(nèi)消化。每隔20分鐘，用吸管吹打一次，觀察液體有否變渾濁，并取少量液體，在相差倒置顯微鏡下觀察。0.4%臺(tái)盼蘭染色計(jì)算活細(xì)胞數(shù)目。接種密度在105數(shù)量級(jí)。置于5%CO2孵箱中培養(yǎng)，每隔3天換液。待細(xì)胞95%融合時(shí)，0.25%胰蛋白酶?jìng)鞔制俊?/p> 鴨胚成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng) 1．材料 1.1 10-12日齡非免疫受精鴨胚 購(gòu)于雅安偏遠(yuǎn)山區(qū) 1.2標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清(FBS) Tianjin.h"y bio.co;ltd 1.3MEM營(yíng)養(yǎng)液（細(xì)胞增殖液；細(xì)胞維持液；洗液） GIBCO Invitrogen Corporation 1.410倍胰酶 （自配） 1.5抗生素 醫(yī)用80萬(wàn)單位青霉素和醫(yī)用100萬(wàn)單位鏈霉素 1.6滅菌的無(wú)鈣、鎂平衡鹽溶液（自配） 2．實(shí)驗(yàn)器材與儀器 2.1實(shí)驗(yàn)器材 國(guó)產(chǎn)玻璃螺旋口細(xì)胞培養(yǎng)瓶（100ml）；培養(yǎng)皿；離心管（10ml）移液管（10ml與1ml）；漏斗；10層紗布；三角錐瓶（100ml）；吸耳；酒精燈；酒精（75%）；碘酒(3%)；火柴；瓶塞；鑷子；濾器及配套濾膜（25mm直徑 孔徑0.22um）；50ml注射器；燒杯；蛋座；記號(hào)筆；離心管架；金屬飯盒；照蛋器。 2.2 實(shí)驗(yàn)儀器 儀器名稱(chēng) 產(chǎn)地 超純水儀 Water pro ps.labconco 電子天平 ShangpingFA2004. 上海天平儀器廠 高壓滅菌儀 HIRAYAMA4 雙蒸水儀 上海亞榮生化儀器廠 Orion臺(tái)式PH測(cè)試儀 868型 OrionResearch.Inc 倒置顯微鏡 OLYMPUS 細(xì)胞培養(yǎng)箱 Queue 臺(tái)式高速低溫離心機(jī) Beckman coultertm 超凈臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司 水浴鍋 國(guó)華電器有限公司 低溫冰箱 海爾集團(tuán) 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 DHG-9140型上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司
3.4 原代鴨胚成纖維細(xì)胞的制備。（10×ATV消化法） 實(shí)驗(yàn)前，無(wú)菌室用紫外線照射30min以上；超凈臺(tái)使用前應(yīng)徹底擦干再用0.1%苯扎溴銨（新潔爾滅）擦拭一遍 。雙手和瓶子表面用75%的酒精消毒。(以下步驟參考文獻(xiàn)[2][4][5][6]進(jìn)行的) ①取10-12日齡發(fā)育良好的鴨胚，氣室向上置于蛋盤(pán)內(nèi)，用碘酒擦拭鴨蛋表面，后用酒精脫碘，并在氣室端打一小孔，沿氣室用鑷子小心剪去蛋殼露出氣囊，以鑷子去除覆蓋于絨毛尿囊摸上的白膜，暴露出尿囊膜及附著的血管。用鑷子撕開(kāi)尿囊膜，夾住鴨胚頸部，移置于一小培養(yǎng)皿中。 ②去除胚的頭，四肢和內(nèi)臟，用基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)液清洗2-3次，直至組織出現(xiàn)透明，倒盡清洗液。 ③用眼科剪剪碎胚體直至0.1-0.5立方毫米 。剪越碎越好。 ④移組織碎塊于三角錐瓶?jī)?nèi)，加0.2ml/胚 的10×ATV 37℃水浴鍋內(nèi)溫 熱消化 2min，后用吸管移至離心管中,用離心機(jī)5000rpm 離心5min棄上清液。 ⑤加入含雙抗的10%血清的基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)液，移離心管下層組織碎塊于三角錐瓶?jī)?nèi)，由于分散的細(xì)胞在沒(méi)有胰蛋白酶的作用下，會(huì)很快聚合成小團(tuán)，為減少細(xì)胞成團(tuán)應(yīng)不斷吹打，直至成細(xì)胞全部分散開(kāi)。 ⑥取滅菌紗布疊成8-10層置于漏斗上并使中部略凹陷，以含雙抗的10%的基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)液潤(rùn)濕紗布，將已吹散的細(xì)胞懸液經(jīng)紗布過(guò)濾除雜。 ⑦過(guò)濾后的細(xì)胞懸液補(bǔ)加含有雙抗的10%血清的基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)液，按10ml裝入細(xì)胞培養(yǎng)瓶（容量為150ml的細(xì)胞瓶），將細(xì)胞瓶置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng) 。2小時(shí)后觀察細(xì)胞貼壁情況，24小時(shí)后確認(rèn)無(wú)污染。一般情況，24小時(shí)后細(xì)胞可基本長(zhǎng)成單層。 豬甲狀腺細(xì)胞原代培養(yǎng)方法 1. 材料 豬甲狀腺由錦州市屠宰場(chǎng)提供。F-12培養(yǎng)基（sigma公司）；胎牛血清（天津血液研究所）；胰蛋白酶（sigma公司）；膠原酶Ⅳ（sigma公司）；牛TSH（sigma公司） 2. 方法 殺豬后迅速取出甲狀腺1～2個(gè)，置于盛有75％酒精的燒杯中，用冰盒送至實(shí)驗(yàn)室（1小時(shí)以?xún)?nèi)）。立即置于pH為7.4的PBS緩沖液（含青鏈霉素）中，反復(fù)漂洗，直至漂洗液清澈透明。去除包膜及結(jié)締組織，用眼科剪子、鑷子將甲狀腺組織剪成１mm3大小的碎塊。置含0.25％胰酶和300U/ml膠原酶的容器中，放于37℃溫箱中消化60min，每隔15min需搖動(dòng)一次。用吸管將上清液的三分之二吸入離心管中，并加入含有胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化。以 1000轉(zhuǎn)／分鐘離心10分鐘后，棄上清。將細(xì)胞沉淀用F-12培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，充分吹打并用不銹鋼網(wǎng)（200目）過(guò)目，再1000轉(zhuǎn)／分離心10分鐘，棄上清。沉淀懸于含15％胎牛血清和１U/L牛TSH的F-12培養(yǎng)基中，臺(tái)盼藍(lán)染色證明活細(xì)胞數(shù)大于95%，調(diào)整細(xì)胞濃度接種于培養(yǎng)板中（１ml／孔）。置于37℃的5%CO2孵箱中，每二至三天換一次液，至細(xì)胞融合成片后用于實(shí)驗(yàn)。 3.結(jié)果 豬甲狀腺細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)，鏡下細(xì)胞貼壁，呈聚集生長(zhǎng)，細(xì)胞呈圓形或橢圓形。 4.討論 胰蛋白酶適于消化細(xì)胞間質(zhì)較少的軟組織如上皮組織、肝、腎等，對(duì)傳代細(xì)胞也非常好。但消化纖維性組織或較硬的癌組織則效果較差。膠原酶對(duì)膠原有很強(qiáng)的消化作用，適于消化纖維性組織、上皮組織以及癌組織等。由于甲狀腺富含纖維性組織，所以甲狀腺的消化分離一般采用膠原酶與胰蛋白酶聯(lián)合消化法，用單一的胰蛋白酶消化效果一般；促甲狀腺激素（TSH）是培養(yǎng)甲狀腺細(xì)胞必備的，它能夠起到促進(jìn)甲狀腺細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。本人也曾嘗試過(guò)不加TSH，與加TSH對(duì)比明顯可見(jiàn)細(xì)胞增長(zhǎng)較慢，且形態(tài)不好。 細(xì)胞原代培養(yǎng) 材料：小鼠 器具：飯盒、紗布、小剪子、小鑷子、大鑷子、大燒杯、平皿、研磨玻片、濾網(wǎng)、離心管（15/50ml）、6孔培養(yǎng)板、吸管、移液管、手套、微量加樣器 試劑：DMEM（含血清）、無(wú)血清 DMEM培養(yǎng)基、膠原酶、PBS 準(zhǔn)備：酒精擦拭臺(tái)面后把物品擺放好，開(kāi)紫外線燈照30分鐘后開(kāi)鼓風(fēng)機(jī)吹至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。 操作步驟： 1、將小鼠斷頸致死，置75%酒精泡 2-3秒鐘，取心臟、肝臟、脾臟、腎臟、肺臟、睪丸或卵巢，置于盛有PBS的平皿中。 2、剔除脂肪、結(jié)締組織、血液等雜物, 轉(zhuǎn)移到另一個(gè)盛有PBS液的平皿中。 3、用手術(shù)剪將臟器剪成小塊（1mm2），玻片研磨，轉(zhuǎn)到離心管，離心1000rpm，5min。 4、視組織或細(xì)胞量加入5-6倍（3-5ml）膠原酶，37℃中消化20分鐘，每隔5分鐘振蕩一次，或用吸管吹打一次，使細(xì)胞分離。 5、加入3-5ml含血清的培養(yǎng)液以終止胰酶消化作用。 6、用100目孔徑濾網(wǎng)濾過(guò)，除去未消化的大組織塊。 7、1000rpm，離心5分鐘，棄上清液。 8、加入無(wú)血清培養(yǎng)液5ml，沖散細(xì)胞，再離心一次，棄上清液。 9、加入含血清的培養(yǎng)液l-2 ml（視細(xì)胞量），血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。 10、將細(xì)胞調(diào)整到5×105/ml左右，轉(zhuǎn)移至6孔培養(yǎng)板中，37℃下培養(yǎng)。 心肌細(xì)胞的分離及培養(yǎng) 器械：飯盒、燒杯、彎頭解剖剪（2）、小鑷子（2）、平皿（4）、毛玻片、濾網(wǎng)、離心管（15ml）、移液管、培養(yǎng)瓶、廢液缸、PE手套、橡膠手套、冰盒 溶液：PBS、DMEM（含血清）、DMEM（free）、胰酶 動(dòng)物：小鼠 準(zhǔn)備：用酒精棉球擦拭臺(tái)面后把物品擺放好，開(kāi)紫外線燈照30分鐘后開(kāi)鼓風(fēng)機(jī)吹至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，提前半小時(shí)將培養(yǎng)液、胰酶37℃溫浴。 培養(yǎng)過(guò)程： 1. 兩個(gè)圓皿中加入5ml的PBS培養(yǎng)液，將小鼠浸入70％酒精&5min，用小剪子及小鑷子開(kāi)胸取心。 2. 取出的心放在一個(gè)裝有PBS的平皿中，剔除心臟周邊的血凝及纖維組織。 3. PBS再?zèng)_洗后，轉(zhuǎn)移至另一個(gè)預(yù)先裝好5ml胰酶的平皿中，用剪子將平皿中的心臟剪成1mm3的碎塊，倒入15ml離心管中，加入3-5ml胰酶沖洗平皿轉(zhuǎn)移到離心管中。 4. 放入水浴鍋中，溫和搖動(dòng)，10min，自然沉淀，小心吸取上清，上清中主要是血紅細(xì)胞、細(xì)胞碎屑和死細(xì)胞。 5. 再將8-10ml胰酶加入盛有組織的離心管，吸管輕輕吹打1min，消化10min，小心轉(zhuǎn)移上清+2ml DMEM至另一離心管中，細(xì)胞懸液離心，1000轉(zhuǎn)×10min，棄上清，加培養(yǎng)基為管1。 6. 重復(fù)第5步，3-8次，直至至組織塊消化為止。 7. 將多次細(xì)胞懸液經(jīng)100目濾網(wǎng)過(guò)濾，混合。 8. 加入1ml DMEM重懸，顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)。 9. 培養(yǎng)1-1.5小時(shí)，收集培養(yǎng)液中的非貼壁細(xì)胞，小心不要晃動(dòng)。 10.顯微鏡觀察并計(jì)數(shù)，細(xì)胞密度調(diào)至5×105-6×105細(xì)胞/ml。 11.4-6小時(shí)后，用培養(yǎng)基輕輕沖洗2次，加入培養(yǎng)基繼續(xù)孵育過(guò)夜。 肝細(xì)胞原代培養(yǎng) 材料：小鼠 器具：飯盒、紗布、小剪子、小鑷子、大鑷子、大燒杯、平皿、研磨玻片、濾網(wǎng)、離心管（15/50ml）、6孔培養(yǎng)板、吸管、移液管、手套、微量加樣器 易生物儀器庫(kù)：http://www.ebioe.com/yp/product-list-42.html 易生物試劑庫(kù)：http://www.ebioe.com/yp/product-list-43.html 試劑：DMEM（含血清）、無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基、胰酶、PBS 準(zhǔn)備：酒精擦拭臺(tái)面后把物品擺放好，開(kāi)紫外線燈照30分鐘后開(kāi)鼓風(fēng)機(jī)吹至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。 操作步驟： 1、將小鼠斷頸致死，置75%酒精泡2-3秒鐘，取肝臟，置于盛有PBS的平皿中。 2、剔除脂肪、結(jié)締組織、血液等雜物,轉(zhuǎn)移到另一個(gè)盛有PBS液的平皿中。 3、用手術(shù)剪將臟器剪成小塊（1mm2），玻片研磨，轉(zhuǎn)到離心管，離心1000rpm，5min。 4、視組織或細(xì)胞量加入5-6倍（3-5ml）胰酶，37℃中消化20分鐘，每隔5分鐘振蕩一次，或用吸管吹打一次，使細(xì)胞分離。 5、加入3-5ml含血清的培養(yǎng)液以終止胰酶消化作用。 6、用100目孔徑濾網(wǎng)濾過(guò)，除去未消化的大組織塊。 7、 1000rpm，離心5分鐘，棄上清液。 8、加入無(wú)血清培養(yǎng)液5ml，沖散細(xì)胞，再離心一次，棄上清液。 9、加入含血清的培養(yǎng)液l-2 ml（視細(xì)胞量），血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。 10、將細(xì)胞調(diào)整到5×105/ml左右，轉(zhuǎn)移至6孔培養(yǎng)板中，37℃下培養(yǎng)。 大鼠胰島細(xì)胞原代培養(yǎng) 一周齡Wistar大鼠，斷頸處死，于 75%乙醇浸泡15分鐘，無(wú)菌取出胰臟，于冰冷無(wú)菌D-Hanks液中漂洗，用眼科剪仔細(xì)清除脂肪、包膜、血管等胰外組織，轉(zhuǎn)入青霉素小瓶中，加入少量無(wú)菌D-Hanks液，用眼科剪剪成0.1-1.0mm3大小的碎片，用滴管輕輕吸出上層細(xì)小脂肪碎塊和油滴，再用無(wú)菌D- Hanks液反復(fù)清洗8~10次，加入10倍體積無(wú)菌消化酶液[胰蛋白酶-膠原酶消化液：0.05g胰蛋白酶(Sigma)，0.025g Ⅴ型膠原酶(Sigma，663U/mg)，0.05g葡萄糖，溶于100 mL無(wú)Ca2+、Mg2+的 0.01mol/LPBS（pH值為7.4）溶液，用0.22μm微孔濾膜濾菌]，38℃±1℃消化，消化過(guò)程中不斷震蕩，10分鐘后吸出上面酶液棄去，用無(wú)菌D-Hanks液將組織塊清洗2~3次，加入新鮮酶液繼續(xù)消化，重復(fù)上述步驟。此時(shí)組織塊邊緣模糊，再將組織塊浸入消化酶液中，38℃±1℃消化 10分鐘，將消化酶液與組織塊分開(kāi)，組織塊重新加入新鮮消化酶液進(jìn)行消化；而原消化酶液1500rpm離心10分鐘，取沉淀即為消化下的細(xì)胞，重新用無(wú)菌 D-Hanks懸浮，離心，重復(fù)1~2次，再用培養(yǎng)基洗2~3次，用培養(yǎng)基懸浮即得細(xì)胞懸液；將消化過(guò)的組織塊重復(fù)消化5~6次至組織塊消化完全，重復(fù)以上操作，合并幾次所得細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105個(gè)細(xì)胞/mL，將細(xì)胞懸液接種于24孔塑料培養(yǎng)板中，每孔1mL，置于37℃，5%CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。由于成纖維細(xì)胞貼壁要比胰島細(xì)胞迅速，接種15小時(shí)后，輕輕振蕩培養(yǎng)板，將上面未貼壁的細(xì)胞接入新的培養(yǎng)板中，可除去部分成纖維細(xì)胞。將新培養(yǎng)板中細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)后，換新鮮配置的含有2.5ng/mL的碘乙酸的培養(yǎng)基培養(yǎng)5小時(shí)，可除去絕大部分成纖維細(xì)胞，而胰島細(xì)胞不受傷害，換不含碘乙酸的培養(yǎng)基洗2次，并換不含碘乙酸的培養(yǎng)基在37℃，5%CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3天換培養(yǎng)液，獲得單層胰島細(xì)胞。 視神經(jīng)少突膠質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)純化及鑒定 1 材料和方法 1.1 DMEM/F12條件培養(yǎng)液（亞硒酸鈉40μg·L-1，腐胺16.2 mg·L-1，轉(zhuǎn)鐵蛋白100 mg·L-1，胰島素234U·L-1，甲狀腺素0.4μg·L-1，黃體酮0.62 mg·L-1，谷氨酰胺3g·L-1）。DMEM/F12培養(yǎng)基、小牛血清購(gòu)自Hyclone公司，兔抗鼠GC抗體、亞硒酸鈉、腐胺等購(gòu)自Sigma公司。 1.2 視神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的來(lái)源、培養(yǎng) 取新生2d的Wistar大鼠10只（第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所動(dòng)物中心提供），無(wú)菌條件下取出雙側(cè)視神經(jīng)。接種至24孔培養(yǎng)板內(nèi)經(jīng)多聚賴(lài)氨酸處理的蓋玻片上。而后加入含30g·L-1小牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，37(C，50mL·L-1 CO2，100%濕度連續(xù)培養(yǎng)3d。3d后棄廢液，改為含5g·L-1小牛血清DMEM/F12條件培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。每周換液2次。在獲得足夠的細(xì)胞數(shù)量后，改用無(wú)血清條件培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，每2d換液一次。 1.3 形態(tài)學(xué)觀察 每天在倒置顯微鏡（日本Olympus），觀察培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程和形態(tài)學(xué)變化并拍照。 1.4 免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定：將含細(xì)胞蓋玻片取出，0.01mol·L-1 PBS沖洗3次×5min；冷丙酮固定10 min；PBS沖洗（3次×5min）；30g·L-1過(guò)氧化氫室溫孵育15min；PBS沖洗3次×5min；滴加正常山羊血清，室溫孵育20 min；滴加1:100 GC抗體，陰性對(duì)照以PBS代替一抗，37(C孵育60min；PBS沖洗3次×5min；滴加生物素標(biāo)記羊抗兔IgG，37(C，20min；PBS沖洗3次×5min；滴加辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液；DAB工作液（武漢博士德公司）顯色，自來(lái)水終止反應(yīng)；脫水，透明，D·P·X封片保存。 2 結(jié)果 2.1 形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果 組織塊24ｈ開(kāi)始貼壁，48～72ｈ可見(jiàn)神經(jīng)組織邊緣游出少量細(xì)胞，主要為圓形或梭形（圖1）。8～9d左右，細(xì)胞基本鋪滿(mǎn)培養(yǎng)孔。此時(shí)改用無(wú)血清條件培養(yǎng)基培養(yǎng)進(jìn)行純化。培養(yǎng)過(guò)程中，部分細(xì)胞死亡。12d左右獲得的細(xì)胞胞體基本為呈圓形或多角型，直徑約6～10μm。細(xì)胞核較大，胞質(zhì)少（圖2）。 2.2 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 培養(yǎng)的視神經(jīng)少突膠質(zhì)細(xì)胞的免疫組織化學(xué)染色GC蛋白陽(yáng)性，未加一抗的呈陰性。染色結(jié)果顯示成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞突起豐富，互相形成蜘蛛網(wǎng)狀（圖3）。蘇木素復(fù)染，異質(zhì)細(xì)胞較少，90%以上為陽(yáng)性細(xì)胞. 3 討論 抑制神經(jīng)再生基因Nogo的發(fā)現(xiàn)為視神經(jīng)損傷的修復(fù)、視功能保護(hù)研究帶來(lái)了希望。視神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞包括星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞2種類(lèi)型,分化不同,功能各異。成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞不再具有分裂增殖能力，為分裂終期細(xì)胞[2]，培養(yǎng)較為困難。 1980年 McCarthy[3]等建立了從腦灰質(zhì)組織分離、純化星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的分離培養(yǎng)模型。目前國(guó)內(nèi)外多采用該法[4]。利用少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞貼壁能力的不同采用振動(dòng)分離法進(jìn)行分離、培養(yǎng)。此法主要用來(lái)獲取星形膠質(zhì)細(xì)胞，獲得的少突膠質(zhì)細(xì)胞較少。存在著操作步驟多容易被污染、分離過(guò)程中因振蕩離心易造成機(jī)械性損傷導(dǎo)致細(xì)胞死亡等缺點(diǎn)。 本實(shí)驗(yàn)采用視神經(jīng)組織塊培養(yǎng)的方法，對(duì)新生大鼠的視神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行條件化原代培養(yǎng)，利用少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)條件的不同，采用條件培養(yǎng)基純化2種細(xì)胞。少突膠質(zhì)細(xì)胞和Ⅱ型星形膠質(zhì)細(xì)胞是從一種普通雙潛能的少突膠質(zhì)細(xì)胞－2型星形膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞（oligodendrocyte-type-2astrocyte progenitor cell，O2A）發(fā)育而來(lái)[2]。大鼠出生后約1周，少突膠質(zhì)細(xì)胞逐漸成熟。因此，從新生大鼠取材可獲得O2A祖細(xì)胞。體外研究發(fā)現(xiàn)甲狀腺素、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、腐胺、黃體酮和微量元素硒等，可使O2A祖細(xì)胞朝少突膠質(zhì)細(xì)胞定向分化。而血清等可以誘導(dǎo)O2A祖細(xì)胞分化為Ⅱ型星形膠質(zhì)細(xì)胞[2、5]。我們利用這一特點(diǎn)，逐步減少條件培養(yǎng)基中的血清濃度，促進(jìn)O2A祖細(xì)胞向少突膠質(zhì)細(xì)胞分化。最終采用無(wú)血清條件培養(yǎng)基，抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞及其它異質(zhì)細(xì)胞增殖，而少突膠質(zhì)細(xì)胞在此條件下則基本不受影響。GC是表達(dá)于少突膠質(zhì)細(xì)胞膜以及髓鞘的一種主要類(lèi)脂，它是識(shí)別少突膠質(zhì)細(xì)胞普遍應(yīng)用的特異性化學(xué)標(biāo)志物[2、 4]。免疫染色鑒定結(jié)果表明純度較高超過(guò)90％。此方法簡(jiǎn)便、可靠、易于推廣，便于對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)課題進(jìn)行研究。 軟骨細(xì)胞培養(yǎng) 軟骨細(xì)胞的原代培養(yǎng) 齡新西蘭乳兔(雌雄不限，共18只，分6次處理),溺死，置于75%酒精溶液中10分鐘，拿入超凈工作臺(tái)，自眼外眥至耳屏前剪開(kāi)皮膚暴露皮下組織，再次嚴(yán)格消毒，自外眥外將顴弓由根部剪斷，暴露髁狀突，去凈髁狀突表面軟組織及軟骨膜，以眼科剪剪取髁狀突表面的透明軟骨，以磷酸緩沖液（PBS含青霉素、鏈霉素各100U/L）沖洗2遍，將軟骨剪切成1－3mm3 左右碎塊，0.25%胰蛋白酶先消化 30-35分鐘，PBS浸洗2遍；后置于50ml玻璃培養(yǎng)瓶，加0.1%Ⅱ型膠原酶(DMEM配制)，37消化3.5－4.5小時(shí)，每小時(shí)置37℃恒溫振蕩箱振蕩5min。直到軟骨塊大部分呈肉眼可見(jiàn)的絮狀物，倒置顯微鏡下觀察，軟骨細(xì)胞大部分分離后，以彎頭吸管輕輕吹打，細(xì)胞懸液以1200r/min離心7分鐘，棄上清，以含10％新生牛血清DMEM的培養(yǎng)液終止消化，離心棄上清以洗去細(xì)胞表面的酶，懸浮細(xì)胞并計(jì)數(shù)，臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞活力為90％。將細(xì)胞以2×105/ml接種于25cm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，置于37 ℃恒溫, 5%CO2 濃度,飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。2天后換液1次，以后隔天更換培養(yǎng)液，倒置顯微鏡觀察、照相記錄細(xì)胞形態(tài)及貼壁生長(zhǎng)情況。待細(xì)胞貼壁達(dá)到85%－90%后傳代。 軟骨細(xì)胞的傳代培養(yǎng) 待細(xì)胞貼滿(mǎn)壁后傳代。傳代時(shí),吸干培養(yǎng)液,用PBS液輕洗細(xì)胞2次，培養(yǎng)皿內(nèi)加入0.25%胰蛋白酶－0.01%EDTA（1比1）消化液,以覆滿(mǎn)瓶底為限,置溫箱2～3 min 后,顯微鏡下觀察到細(xì)胞質(zhì)已回縮,細(xì)胞間隙增大，即向培養(yǎng)皿里滴入2 mL 左右含血清的培養(yǎng)液終止消化,收集第1代培養(yǎng)細(xì)胞，用彎頭吸管吸取混和液,反復(fù)多次輕吹皿底細(xì)胞,使細(xì)胞徹底從培養(yǎng)瓶底壁脫落,收集細(xì)胞混和液, 1200r/min離心7分鐘, 棄上清，以含10％新生牛血清的DMEM清洗細(xì)胞3次,制成細(xì)胞懸液，將細(xì)胞以2×105/ml 接種于25cm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，置于37 ℃恒溫, 5%CO2 濃度,飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。隔天更換DMEM培養(yǎng)液。以第3代軟骨細(xì)胞制成細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)，臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞活力為90%，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×107/ml, 用于實(shí)驗(yàn)。 傳代 吸干培養(yǎng)液,用PBS 液輕洗細(xì)胞2次,培養(yǎng)皿內(nèi)加入0.25 %的胰蛋白酶,以覆滿(mǎn)皿底為限,置溫箱2～3 min 后,顯微鏡下觀察到細(xì)胞質(zhì)已回縮,細(xì)胞間隙增大,少部分細(xì)胞已浮于消化液中,用吸管吸取混和液,反復(fù)多次輕吹皿底細(xì)胞,使細(xì)胞徹底從培養(yǎng)皿底壁脫落,收集細(xì)胞混和液,離心,用PBS 液漂洗2 次,再制成細(xì)胞懸液,計(jì)數(shù),檢查細(xì)胞活力,按每個(gè)培養(yǎng)皿接種2 ×105 個(gè)細(xì)胞再培養(yǎng)。 兔膀胱平滑肌細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定 一、摘要 目的：建立兔膀胱平滑肌細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定的方法。方法：成年新西蘭白兔兩只（正常及梗阻各一只），采用酶法分離技術(shù)獲得膀胱平滑肌細(xì)胞后于10%小牛血清的DMEM中培養(yǎng)，觀察細(xì)胞形態(tài)和擴(kuò)增情況，用爬片染色、電鏡、蛋白質(zhì)α-肌動(dòng)蛋白（α-actin）鑒定細(xì)胞類(lèi)型。結(jié)果：倒置顯微鏡下觀察均呈 “谷和峰”樣結(jié)構(gòu)、細(xì)胞爬片HE染色及電鏡檢查均證實(shí)為平滑肌細(xì)胞。免疫組化染色檢測(cè)α-actin呈陽(yáng)性反應(yīng)。從細(xì)胞爬片HE染色和免疫組化染色檢測(cè) α-actin呈陽(yáng)性反應(yīng)中我們發(fā)現(xiàn)該方法所的膀胱平滑肌細(xì)胞的純度幾乎99%。結(jié)論：該方法易行、可靠、在短期內(nèi)可獲得大量高純度膀胱平滑肌細(xì)胞。 二、 材料及方法 1、 試劑及標(biāo)本 成年同齡雄性新西蘭白兔2只，體重約2.5~3k(購(gòu)于南京軍區(qū)南京總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)，一只為正常成年雄性新西蘭白兔，一只為膀胱出口不全梗阻8周成年雄性新西蘭白兔。DMEM、Ⅱ型膠原酶及α-肌動(dòng)蛋白抗體（α-actin）購(gòu)于北京華美公司；胎牛血清購(gòu)于杭州四季青公司；胰蛋白酶購(gòu)于南京生興公司。 2、 膀胱平滑肌細(xì)胞酶法分離 肌注鹽酸氯胺酮200mg及氟哌利多 5mg麻醉，待兔進(jìn)入麻醉狀態(tài)后消毒，下腹正中切口，迅速切取膀胱組織。超凈臺(tái)內(nèi)依次慶大霉素溶液（濃度為100單位/毫升）、生理鹽水及D-Hanks 液中浸泡洗滌5分鐘，然后放入D-Hanks液中除去黏膜、黏膜下及漿膜層。肌肉剪成肉糜后0.1%膠原酶（Ⅱ型2mg/ml）溶液40過(guò)夜消化（約 10-12小時(shí)）。然后加0.25%胰蛋白酶370消化30分鐘，消化液變混濁呈絮狀提示消化良好。用100目細(xì)胞篩過(guò)濾該絮狀液，混懸液離心（1000 轉(zhuǎn)/分，離心半徑13cm）5分鐘，沉淀的細(xì)胞移入培養(yǎng)皿，加入含10%胎牛血清的DMEM，置于50ml/L CO2、37度飽和濕度孵育箱中靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)液每周更換2-3次。 3、 傳代培養(yǎng) 待培養(yǎng)的細(xì)胞通過(guò)增殖達(dá)到約80%匯合狀態(tài)時(shí)做傳代處理。棄去原培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)液，加入適量的PBS(因培養(yǎng)液中的胎牛血清對(duì)胰蛋白酶有抑制作用)，輕輕搖動(dòng)，清洗殘留的培養(yǎng)液后棄之。加入適量的消化液，使其覆蓋整個(gè)細(xì)胞，將培養(yǎng)瓶放置于CO2培養(yǎng)箱，不時(shí)在倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞胞質(zhì)回縮，胞間間隙增大后，吸出消化液，并向培養(yǎng)瓶中加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)液終止消化。用吸管吸取培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁制備細(xì)胞懸液，吹打時(shí)不能用力過(guò)猛，盡量不出現(xiàn)氣泡，以免損傷細(xì)胞。細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)后，按照1X105~106密度將細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中。 4、 培養(yǎng)細(xì)胞的觀察及鑒定 采用倒置顯微鏡觀察平滑肌細(xì)胞的形態(tài)及生長(zhǎng)情況。細(xì)胞爬片HE染色觀察細(xì)胞形態(tài)。電鏡檢查。免疫組化染色檢測(cè)α-actin。 結(jié)果 兩只兔所有標(biāo)本均獲成功。倒置顯微鏡觀察平滑肌細(xì)胞24小時(shí)均可見(jiàn)膀胱平滑肌細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，正常兔7天左右、而梗阻兔則需10~12天可于50毫升培養(yǎng)瓶約80%匯合。均傳代順利，傳代后約正常兔6天左右、而梗阻兔需8~9天可于50毫升培養(yǎng)瓶約80%匯合。本組中均傳至第8代，經(jīng)第8次傳代后，平滑肌細(xì)胞仍生長(zhǎng)迅速，未見(jiàn)衰老跡象。倒置顯微鏡下觀察均呈“谷和峰”樣結(jié)構(gòu)（圖1 對(duì)照組2周的細(xì)胞；圖2 實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)2周的細(xì)胞）。細(xì)胞爬片HE染色見(jiàn)膀胱平滑肌細(xì)胞細(xì)胞核呈兩端鈍圓的卵圓形平滑肌細(xì)胞核型(見(jiàn)圖3)。電鏡檢查可見(jiàn)平滑肌細(xì)胞密班結(jié)構(gòu)（圖4分離后培養(yǎng)細(xì)胞的電鏡檢查發(fā)現(xiàn)平滑肌細(xì)胞致密班結(jié)構(gòu)）。免疫組化染色檢測(cè)α-actin呈陽(yáng)性反應(yīng)（圖5）。從細(xì)胞爬片HE染色和免疫組化染色檢測(cè)α- actin呈陽(yáng)性反應(yīng)中我們發(fā)現(xiàn)該方法所的膀胱平滑肌細(xì)胞的純度幾乎99%。 三、 討論 平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng)方法可分為兩類(lèi)：組織塊法和酶消化法。組織塊法適用于細(xì)嫩、易碎的組織；其方法較簡(jiǎn)單；但容易產(chǎn)生雜質(zhì)如成纖維細(xì)胞等，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)快，故培養(yǎng)之細(xì)胞質(zhì)量較差；培養(yǎng)的大多數(shù)細(xì)胞無(wú)收縮性；且原代細(xì)胞的獲得需3~4周，獲得大量平滑肌細(xì)胞耗時(shí)長(zhǎng)（17）。既往酶消化法較組織塊法復(fù)雜、精細(xì)；適宜的酶濃度和培養(yǎng)時(shí)間的確定較為困難；然而在較短時(shí)間內(nèi)可獲得大量的平滑肌細(xì)胞，1996年有學(xué)者報(bào)道（Chambers（18）等）酶消化法純度為 70%?？梢?jiàn)一種快速、高效、高純度的酶消化法培養(yǎng)膀胱平滑肌的方法顯得尤為重要。 本實(shí)驗(yàn)研究?jī)芍煌盟袠?biāo)本均獲成功。倒置顯微鏡觀察平滑肌細(xì)胞24小時(shí)均可見(jiàn)膀胱平滑肌細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，正常兔7天左右、而梗阻兔則需10~12天可于50毫升培養(yǎng)瓶約80%匯合。均傳代順利，傳代后約正常兔6天左右、而梗阻兔需8~9天可于50毫升培養(yǎng)瓶約80%匯合。本組中均傳至第8代，經(jīng)第8次傳代后，平滑肌細(xì)胞仍生長(zhǎng)迅速，未見(jiàn)衰老跡象。倒置顯微鏡下觀察均呈“谷和峰”樣結(jié)構(gòu)。細(xì)胞爬片HE染色見(jiàn)膀胱平滑肌細(xì)胞細(xì)胞核呈兩端鈍圓的卵圓形平滑肌細(xì)胞核型。電鏡檢查可見(jiàn)平滑肌細(xì)胞密班結(jié)構(gòu)。免疫組化染色檢測(cè)α-actin呈陽(yáng)性反應(yīng)。從細(xì)胞爬片HE染色和免疫組化染色檢測(cè)α-actin呈陽(yáng)性反應(yīng)中我們發(fā)現(xiàn)該方法所的膀胱平滑肌細(xì)胞的純度幾乎 99%（在以下的膀胱平滑肌細(xì)胞的共聚焦檢測(cè)中也證實(shí)了這一點(diǎn)）。 膀胱平滑肌的鑒定（10）主要根據(jù)其細(xì)胞形態(tài)及α-actin的檢測(cè)。倒置顯微鏡下觀察均呈“谷和峰”樣結(jié)構(gòu)；細(xì)胞爬片HE染色見(jiàn)膀胱平滑肌細(xì)胞細(xì)胞核呈兩端鈍圓的卵圓形平滑肌細(xì)胞核型；電鏡檢查可見(jiàn)平滑肌細(xì)胞密班結(jié)構(gòu)，這些細(xì)胞形態(tài)學(xué)的檢測(cè)均證實(shí)其為膀胱平滑肌細(xì)胞。免疫組化染色檢測(cè)α-actin呈陽(yáng)性反應(yīng)更進(jìn)一步證實(shí)了該方法所獲得的細(xì)胞為膀胱平滑肌細(xì)胞。已有學(xué)者通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：酶消化法獲得的膀胱平滑肌細(xì)胞細(xì)胞膜通道的密度有所下降；細(xì)胞膜電位和細(xì)胞膜電阻稍微降低。他們認(rèn)為通過(guò)酶消化法所獲得的膀胱平滑肌細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)、傳代后仍基本保持著原有的電生理特性，由此在體外研究的結(jié)果可較好的反映體內(nèi)情況（21）（20）。梗阻后的膀胱平滑肌細(xì)胞在生長(zhǎng)擴(kuò)增中明顯較正常膀胱平滑肌細(xì)胞時(shí)間長(zhǎng)，也說(shuō)明了這種酶消化法對(duì)膀胱平滑肌細(xì)胞的影響不是太大，還是保留著體內(nèi)的基本特性。在我們的激光掃描共聚焦顯微鏡的檢測(cè)中平滑肌細(xì)胞內(nèi)的鈣離子熒光強(qiáng)度在M受體激動(dòng)劑的影響下發(fā)生明顯變化，這更進(jìn)一步證實(shí)了該方法分離培養(yǎng)出的膀胱平滑肌仍保持著收縮功能。 從實(shí)驗(yàn)研究中我們體會(huì)到該方法：1、簡(jiǎn)便、易行、易掌握及短期內(nèi)可獲大量高質(zhì)單個(gè)膀胱平滑肌細(xì)胞；2、應(yīng)嚴(yán)格無(wú)菌操作；3、仔細(xì)徹底剝除膀胱黏膜、黏膜下及漿膜層，是確保獲的大量高質(zhì)單個(gè)膀胱平滑肌細(xì)胞的基礎(chǔ)；4、膀胱平滑肌組織應(yīng)盡量減碎以確保充分消化；5、嚴(yán)格控制膠原酶和胰蛋白酶的濃度和消化時(shí)間，見(jiàn)消化液混濁、組織塊呈絮狀，或在倒置顯微鏡下見(jiàn)消化液中有較多單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞小團(tuán)塊時(shí)即終止消化；6、細(xì)胞篩的運(yùn)用也是獲得高質(zhì)單個(gè)膀胱平滑肌細(xì)胞的基礎(chǔ)。 1. Chamley CJ,Campbell GR,Ross R.The smooth muscle cells in culture.Physiol Rev 1979 59（1）:1-61. 2. Chambers P,Neal DE,Gillespie JI.Ca2+ signalling in cultured smooth muscle cells from human bladder .1996 Exp Physiol 81 (4):553-564. 3．Korkmaz M, Guvenc BH, Bilir A et al. Isolation and culture of adult and fetal rabbit bladder smooth muscle cells and their interaction with biopolymers.J Pediatr Surg. 2003 Jan;38(1):21-24. 4.Sui GP, Wu C, Fry CH .A description of Ca2+ channels in human detrusor smooth muscle. BJU Int. 2003 Sep;92(4):476-478. 5. Sui GP, Wu C, Fry CH. The electrophysiological properties of cultured and freshly isolated detrusor smooth muscle cells.J Urol. 2001 Feb;165(2):627-632. SD大鼠VSMC的原代培養(yǎng)(貼塊法) 實(shí)驗(yàn)材料：手術(shù)剪1把、手術(shù)鉗2把、眼科剪刀2把 、眼科鑷子1把 、大頭針4個(gè)、手術(shù)刀片、無(wú)菌1×PBS約500ml 20%FBS的DMEM、5ml小皿3個(gè)、 10ml大皿1個(gè)、殺鼠板1塊。（以上均為無(wú)菌物品） 實(shí)驗(yàn)步驟 1、 150-200gSD-大鼠，短頭，浸入75%的酒精中15min 2、 置入超凈臺(tái)中，將大鼠固定于殺鼠板上，在無(wú)菌條件下打開(kāi)腹腔，分離出胸主、腹主，摘出。 3、 PBS清洗3遍，剝?nèi)ネ饽?，用手術(shù)刀片刮去內(nèi)膜，留下中膜并將其移入1ml的培基中、剪成1×1mm大小組織塊。 4、再將PBS清洗組織塊，移入25ml 的培養(yǎng)瓶中，用尖嘴彎管均勻貼好組織塊，放入37度5％CO2的培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)6小時(shí)后，待組織塊貼壁后，再加入2.5ml培養(yǎng)液后放回37度5％CO2 的培養(yǎng)箱中。注意：最后加入2ml培養(yǎng)液時(shí)應(yīng)使其順無(wú)組織塊的皿邊緣緩慢流下，勿使組織塊吹下。 5、 隨后每3天予以全量換液。 6、 3-5天后可見(jiàn)組織塊周?chē)屑?xì)胞爬出，大約2周后80％融合。 本人曾做過(guò)3個(gè)月的SD大鼠VSMC的原代培養(yǎng)，基本上的所有的障礙都遇到過(guò)，現(xiàn)在已做的相當(dāng)成功，并樂(lè)意與大家分享經(jīng)驗(yàn)！ 脾臟單個(gè)核細(xì)胞懸液的制備 (1) 大鼠斷頸處死后，無(wú)菌取脾置于消毒平皿中稱(chēng)重 (2) 超凈工作臺(tái)上置10cm直徑無(wú)菌平皿，加入5～10ml D-hanks平衡液 ，置一80目的不銹鋼篩于平皿中，脾臟置于篩網(wǎng)中，用剪刀剪碎脾，用5ml玻璃注射器針芯輕輕捻磨脾臟，使分散的細(xì)胞濾過(guò)金屬網(wǎng)進(jìn)入平皿的液體中， D-hanks沖洗一次； (3) 用吸管吸取沖洗液，200目的鋼篩過(guò)濾一次后收集至離心管中； (4) 1000rpm，離心5～10min，棄上清； (5) 加入約1ml雙蒸水，吸管打勻后20s后加入等量的1.8%的NaCl溶液，然后加入大量D-hanks調(diào)節(jié)滲透平衡，以***紅細(xì)胞，但對(duì)白細(xì)胞沒(méi)有影響； 用D-hanks液洗滌細(xì)胞2～3次，用含有1mM/L的谷氨酸胺、100IU/ml青霉素G、100μg/ml鏈霉素、 10%的胎牛血清的RPMI－1640重懸細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為5×106/ml，臺(tái)盼蘭染色檢測(cè)細(xì)胞存活率大于95％； (7) 接種至培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶中。 豬肺泡巨噬細(xì)胞的培養(yǎng) 1、細(xì)胞培養(yǎng)所用溶液及其配制 1×RPMI1640及：按照產(chǎn)品說(shuō)明配制，過(guò)濾除菌，4℃保存?zhèn)溆谩?/p> 新生牛血清：56℃滅活 30min，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p> 2×104U/ml青、鏈霉素液（雙抗）：青鏈霉素各2×106 U溶于100ml滅菌雙蒸水中，過(guò)濾除菌，分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p> 10×Na2EDTA-胰酶溶液（2.5%）：Na2EDTA 0.2g，NaCl 8.0g，KCl 0.2g ，Na2HPO4.12H2O 2.89g，KH2PO4 0.2g，1%酚紅溶液1.5ml，胰酶（1:250）2.5g，溶于100ml雙蒸水中，NaOH調(diào)節(jié)pH至7.2~7.5，過(guò)濾除菌，分裝，-20℃ 保存?zhèn)溆?，使用時(shí)1∶10倍稀釋。 7.5%NaHCO3： 7.5g NaHCO3溶于100ml雙蒸水中，115℃高壓滅菌15min，置4℃冰箱冷藏備用。 10% RPMI1640營(yíng)養(yǎng)液：于1×RPMI1640溶液中加入10%小牛血清，按照1% 比例加入2×104U/ml雙抗，用0.5% NaHCO3或10% HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至7.2~7.4。
2、將50日齡的SPF仔豬放血，結(jié)扎氣管后無(wú)菌摘取其肺臟，先用0.9%的生理鹽水洗滌外表面，將pH7.2的PBS30.0ml從氣管灌入肺臟，輕輕拍打肺表面，1~2min后回收灌洗液，如此反復(fù)進(jìn)行，直至灌洗液清亮為止。將回收的支氣管肺泡灌洗液用吸管輕輕吹打，將細(xì)胞團(tuán)塊打散，用單層無(wú)菌100目不銹鋼篩過(guò)濾，收集全部灌洗液，2000r/min離心10min，收集沉淀。洗滌兩次后加入適量含10%胎牛血清的1×RPMI1640營(yíng)養(yǎng)液吹散細(xì)胞，置培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中于37 度CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待其貼壁后棄去上清及非黏附細(xì)胞繼續(xù)用含10%胎牛血清的1×RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)備用。 神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng) 一．設(shè)備： 無(wú)菌操作設(shè)備。 二．大型設(shè)備CO2培養(yǎng)箱：恒溫5%、10%CO2維持培養(yǎng)液中pH值。 倒置顯微鏡：用于每天觀察貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)情況。 解剖顯微鏡，用于準(zhǔn)確地取材。 常溫冰箱：-4℃，用于保存各種培養(yǎng)液，解剖液和鼠尾膠。 低溫冰箱：-20℃--80℃，用于儲(chǔ)存血清酶，貴重物品和試劑。 電熱干烤箱：用于消毒玻璃器皿。高壓消毒鍋：用于消毒培養(yǎng)皿，手術(shù)器械。 過(guò)濾器：配制解剖液、培養(yǎng)液，必須過(guò)濾后才可使用，以去除細(xì)菌。 滲透壓儀，pH劑，天平等. 三．培養(yǎng)器皿及手術(shù)器械 1.培養(yǎng)皿：常用35mm塑料及玻璃皿，解剖取材用15mm-90mm直徑。 2.培養(yǎng)板，24-40孔，可用于開(kāi)放培養(yǎng)。 3.培養(yǎng)瓶； 4.吸管，常用1，5，10ml，均需泡酸、洗滌、滅菌后方可使用。 5.各類(lèi)培養(yǎng)液貯存器。 6.小型手術(shù)器械。 準(zhǔn)備： 一.配制培養(yǎng)液 （1）解剖液：以無(wú)機(jī)鹽（去除Ca2+, Mg2+）加葡萄糖配制成PBS 緩沖液，保持一定的滲透壓和pH值。 （2）基礎(chǔ)培養(yǎng)基（MEM）：主要為多種氨基酸，加入葡萄糖，雙蒸餾水溶解。 （3）接種培養(yǎng)液：用于胰酶消化后的細(xì)胞分散，做成細(xì)胞懸液，其成分為MEM含1%谷氨酰胺，另加入10%馬血清，當(dāng)天配制。 （4）維持培養(yǎng)液：接種后24h，全部換成此液，后每2周換一次，每次換1/2。其成分為MEM中含5%馬血清，1%谷氨酰胺，及適量的支持性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。 二.培養(yǎng)基質(zhì) 常用鼠尾膠、小牛皮膠，多聚賴(lài)氨酸，再涂膠 三.消毒培養(yǎng)皿的備用。所有培養(yǎng)器皿均需清水沖洗2-3d，達(dá)兩次ddH2O，每遍洗刷3-4次，加塞包裝，置于烤箱中干燥消毒，于培養(yǎng)前1天進(jìn)行。
神經(jīng)細(xì)胞分散培養(yǎng) （一）選材 常用胚胎動(dòng)物或新生鼠神經(jīng)組織。雞胚常用胚齡6-8d，新生鼠或胎鼠（12-14d）或人胚胎。不過(guò)也有認(rèn)為與組織相關(guān)。如大白鼠胚胎以19d為宜，小鼠以18d為宜，大鼠紋狀體以10d為宜；若紋狀體與黑質(zhì)聯(lián)合培養(yǎng)的大鼠胚，則黑質(zhì)以13d，紋狀體18-21d為宜；小腦以20-21d小鼠胚胎，所獲蒲氏細(xì)胞成活率高，顆粒細(xì)胞正在分化；脊髓與DRG聯(lián)合培養(yǎng)，常用4-7d雞胚或12-14d小鼠胚胎，取材易，神經(jīng)成活率高。 （二）取材。腦則取出相應(yīng)組織，在解剖液中先剪碎，以使胰酶消化。脊髓則固定于瓊脂板上，用小刀將其要成背腹兩側(cè)，分別培養(yǎng)。 （三）細(xì)胞分離與接種。神經(jīng)組織用0.125-0.25%胰蛋白酶在37℃孵育30min，移入接種液，停止消化，并洗去胰蛋白酶液，用細(xì)口吸管吹打細(xì)胞懸液，使其充分分散，如此多次，待沉淀后吸出上層細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，預(yù)置細(xì)胞密度，接種于培養(yǎng)皿（1×106），做電生理應(yīng)為5×105或更低。 （四）抑制膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)。培養(yǎng)3-5d后，也有人認(rèn)為培養(yǎng)7d后，用阿糖胞苷，或5-FU抑制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)。 大鼠心室肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的原代培養(yǎng) 材料和方法 1. 儀器： 手術(shù)器械一套，倒置顯微鏡（Leica）,CO2細(xì)胞孵育箱（Heraeus），超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司），掃描電子顯微鏡（Hitachi）。 2. 主要試劑 DMEM 高糖培養(yǎng)基（Gibco），胎牛血清（Hyclone，杭州四季青生物工程材料公司），胰蛋白酶、EDTA（Ameresco）；小鼠抗人CD105單克隆抗體（NeoMarkers），兔抗人CD34、CD31多克隆抗體（Antibody Diagnostica Inc），兔抗人vW因子多克隆抗體（華美公司），抗兔及抗鼠ABC試劑盒、DAB顯色試劑盒為華美公司產(chǎn)品，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純以上級(jí)別。 3. 方法 3.1 植塊法原代細(xì)胞培養(yǎng)[1]： 細(xì)胞培養(yǎng)瓶的處理[2]：選用50ml玻璃培養(yǎng)瓶，高壓蒸汽滅菌，瓶底鋪?zhàn)灾剖笪材z（制作方法參見(jiàn)2），移入80℃烤箱烤干，臨用前用消毒D-Hanks平衡鹽緩沖液沖洗3次。 選用80克SD大鼠（雌雄不限，購(gòu)自復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部），1%戊巴比妥鈉（1ml/100g）腹腔注射麻醉，75%酒精浸泡5min消毒，將大鼠移至超凈臺(tái)進(jìn)行操作，止血鉗固定四肢，逐層打開(kāi)胸腔，暴露心臟，剪開(kāi)心包，由升主動(dòng)脈處剪下心臟，放入D-Hanks平衡鹽緩沖液中，沖凈心腔中的血液，辨清心臟解剖結(jié)構(gòu)，去除大血管、左右心房以及右心室和室間隔，保留左心室，小心去除心內(nèi)膜及心外膜，用眼科剪剪碎余下的心室肌約2mm見(jiàn)方，滴加1ml進(jìn)口胎牛血清，均勻接種于處理過(guò)的50ml培養(yǎng)瓶中，放入37℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞孵育箱靜置培養(yǎng)，使其貼壁，4小時(shí)后追加20%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液4.5ml/瓶，約48小時(shí)后組織塊周?chē)行切渭?xì)胞長(zhǎng)出，80至96小時(shí)組織塊周?chē)写罅考?xì)胞長(zhǎng)出，去除組織塊，繼續(xù)培養(yǎng)36-48小時(shí)，待細(xì)胞匯合鋪滿(mǎn)瓶底后用含0.125%胰蛋白酶、0.02%EDTA的消化液消化細(xì)胞進(jìn)行傳代，取用第二代細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步鑒定和實(shí)驗(yàn)。 （五）觀察。接種6-12h，開(kāi)始貼壁，并有集合現(xiàn)象，細(xì)胞生長(zhǎng)突起明顯，5-7d膠質(zhì)細(xì)胞增生明顯，7-10d膠質(zhì)細(xì)胞成片于神經(jīng)細(xì)胞下面，形成地毯，2周時(shí)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)最豐滿(mǎn)，四周暈光明顯，一個(gè)月后，有些神經(jīng)細(xì)胞開(kāi)始退化，變形，甚至出現(xiàn)空泡，一般培養(yǎng)2-4周最宜。 但神經(jīng)細(xì)胞只能增大，而不能增殖，只能原代，不能傳代，不會(huì)有細(xì)胞周期，而且隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞數(shù)量在下降，但膠質(zhì)細(xì)胞可以，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞也可以。在培養(yǎng)過(guò)程中，早期9-12d時(shí)，有較多的神經(jīng)細(xì)胞死亡，這是第一次死亡階段，應(yīng)注意保持條件的恒定。在此之后存活下去的細(xì)胞一般突起長(zhǎng)而多，且相互形成突觸。 骨髓基質(zhì)細(xì)胞的原代 材料方法 1. 材料： 1.1材料來(lái)源：取自健康成人行骨髓內(nèi)固定術(shù)擴(kuò)髓前收集骨髓腔內(nèi)骨髓。 1.2主要試劑：DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、β-甘油磷酸鈉（β-GP）、維生素C、青鏈霉素 、胰蛋白酶（1:250）-EDTA 1.3主要儀器設(shè)備 雙人超凈臺(tái) Farma Scientific美國(guó) 、單人超凈臺(tái) Farma Scientific美國(guó)、二氧化碳孵箱、Farma Scientific美國(guó)、低溫冰箱 Farma Scientific美國(guó)、倒置相差顯微鏡 Nikon 日本、細(xì)胞培養(yǎng)皿35Ф Corning 美國(guó)、6孔、96孔培養(yǎng)板 Corning 美國(guó) 2. 方法 2.1原代細(xì)胞培養(yǎng)：于髓內(nèi)釘內(nèi)固定術(shù)擴(kuò)髓前，用肝素化后的注射器抽取3-5ml骨髓，置入預(yù)裝有DMEM培養(yǎng)液的無(wú)菌 50ml離心管帶至實(shí)驗(yàn)室。1000rpm離心10分鐘棄上層脂肪，取沉淀細(xì)胞加入適量DMEM， 22G針頭吹打成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)后按所需濃度接種于培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板，加入完全培養(yǎng)液（含青鏈霉素各100u/ml,體積分?jǐn)?shù)10%的胎牛血清、β- GP 10mmol/L、維生素C 50ng/ml、高糖DMEM）置于37℃,含體積分?jǐn)?shù)5%的CO2 濕化空氣孵箱中培養(yǎng)，3天后半量換液，以后隔日全量換液，倒置相差顯微鏡每日觀察細(xì)胞生化情況。 2.2傳代培養(yǎng)：原代培養(yǎng)至7-8天，細(xì)胞接近80%融合倒出培養(yǎng)液，1×PBS清洗兩遍，用0.25%胰蛋白酶加 0.02%EDTA消化細(xì)胞2分鐘，鏡下觀察至細(xì)胞分離脫壁后，立即加入完全培養(yǎng)液終止消化，細(xì)胞刮刀刮除細(xì)胞，將瓶?jī)?nèi)液體吸入離心管，1000rpm離心10分鐘，棄上清，加入完全培養(yǎng)液將細(xì)胞重懸，并混合均勻計(jì)數(shù)后接種于培養(yǎng)皿，行傳代培養(yǎng)。 胚胎小鼠紋狀體神經(jīng)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定 ①原代細(xì)胞的培養(yǎng)：取孕13.5天昆明種二級(jí)孕小鼠，引臼脫頸處死,碘酒、乙醇消毒腹部,逐層剖開(kāi)腹部皮膚、肌肉、腹膜，取出子宮,放入盛有D1-SGH液的器皿中。仔細(xì)剝離胎膜、羊膜，暴露胎鼠，剪開(kāi)顱骨，取出胎鼠腦組織并轉(zhuǎn)移至另一盛有D1-SGH液的器皿中，體視顯微鏡下剝離腦膜,分離胎鼠紋狀體，仔細(xì)剝離血管及腦膜，將收集到的紋狀體在D-hanks液中漂洗兩次，置于盛有 4℃D-hanks液的器皿中，用虹膜剪將組織剪碎,加入0.125℅的胰酶消化(37℃，15min)，期間每隔5min震蕩一次。500轉(zhuǎn)離心 5min, 棄上清，D-hanks液清洗兩次，將沉淀細(xì)胞重懸于增殖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基成分：DMEM/F12（1：1），2% B27 supplement，青霉素、鏈霉素各100U/ml，EGF 20 ng/mL，b-FGF 10ng/mL。用火焰拋光的吸管反復(fù)吹打，分散組織制成單細(xì)胞懸液，吸取9滴細(xì)胞懸液、1滴0.4℅臺(tái)盼藍(lán)溶液混合，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板在3分鐘內(nèi)計(jì)數(shù)出活細(xì)胞和死細(xì)胞（臺(tái)盼藍(lán)排斥法），調(diào)整細(xì)胞密度，以105個(gè)/ mL接種75mL培養(yǎng)瓶中（NUNC）, 于5℅CO2 培養(yǎng)箱, 37℃培養(yǎng)。期間倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況。 ②傳代培養(yǎng)：當(dāng)神經(jīng)球直徑大約100um時(shí)收集細(xì)胞于離心管中，600轉(zhuǎn)離心5分鐘，棄上清，加入無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，吸管輕輕吹打細(xì)胞，使之形成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后以104個(gè)/ mL接種75mL培養(yǎng)瓶中，于5℅CO2 培養(yǎng)箱, 37℃培養(yǎng)，完成一次傳代。此后每隔兩天半量換液，5-7天機(jī)械分離細(xì)胞傳代1次。期間倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況。 兔晶狀體上皮細(xì)胞培養(yǎng)方法和體會(huì)： 1、原代培養(yǎng)：健康成年白家兔空氣栓塞處死,立即取出眼球,1∶1000慶大霉素生理鹽水沖洗干凈,置超凈工作臺(tái)無(wú)菌操作。角膜緣剪開(kāi)去除角膜、虹膜,將晶狀體前囊膜連同赤道部囊膜撕下,Hank液沖洗,剪成1mm×1mm小塊,上皮面向下置25mL組織培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)貼壁培養(yǎng)。把培養(yǎng)瓶輕輕翻轉(zhuǎn),加入適量的加入含15%胎牛血清的DNEM營(yíng)養(yǎng)液,囊膜片在瓶?jī)?nèi)的上面而培養(yǎng)液在下面。置于37℃、5%CO2、95%空氣、100%濕度的CO2培養(yǎng)箱中孵育4-6h左右,待囊膜片貼壁后再將培養(yǎng)瓶調(diào)回原位,此時(shí)培養(yǎng)液覆蓋囊膜片而不使囊膜片漂浮,每周換液2次。晶體上皮細(xì)胞在接種3天后,在倒置顯微鏡下可見(jiàn),植塊邊緣有新生的細(xì)胞爬出,細(xì)胞呈規(guī)則六邊形,大小均勻,胞質(zhì)透明。一周后可融合成小片細(xì)胞。二周后可長(zhǎng)滿(mǎn)融合成單層細(xì)胞。細(xì)胞多為類(lèi)圓形、多角形。 2、傳代培養(yǎng)：細(xì)胞鋪滿(mǎn)瓶底或生長(zhǎng)到一定密度時(shí),用0.25%胰蛋白酶消化,1∶2傳代培養(yǎng)。傳代時(shí)在培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿底放置適當(dāng)大小的蓋玻片,細(xì)胞生長(zhǎng)其上,便于光鏡及免疫組化觀察。細(xì)胞一般24h內(nèi)貼壁,約3～4d細(xì)胞可達(dá)融合,融合的細(xì)胞和原代相似,大小基本一致。傳代超過(guò)4～6代時(shí),細(xì)胞的增長(zhǎng)顯著下降,轉(zhuǎn)變成成纖維細(xì)胞形、三角形和長(zhǎng)形。 3、個(gè)人體會(huì)：晶狀體上皮細(xì)胞位于晶狀體前囊膜及赤道部囊膜下，單層排列，沒(méi)有其他細(xì)胞成分，是絕對(duì)的單一細(xì)胞培養(yǎng)。但細(xì)胞數(shù)量少較難貼壁。所以采用先置于培養(yǎng)瓶待其貼壁后翻轉(zhuǎn)浸入培養(yǎng)液。另外要注意將囊膜剪小，上皮面向下，操作時(shí)有點(diǎn)難度的。培養(yǎng)基沒(méi)什么特別的，用小牛血清也可以，但生長(zhǎng)較慢。一般把多個(gè)囊膜置于同一培養(yǎng)瓶加大組織密度，效果較好。 |
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